糙皮側(cè)耳2-Cys Prx基因功能的研究.pdf

1、糙皮側(cè)耳除了富含氨基酸和維生素外，還含有適量的碳水化合物和礦物質(zhì)，具有藥用性能，生態(tài)價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。氧化應(yīng)激對(duì)易受外界環(huán)境脅迫的糙皮側(cè)耳會(huì)產(chǎn)生不利的影響，因此，它已經(jīng)進(jìn)化出一系列抗氧化機(jī)制來(lái)清除活性氧(Reactiveoxygen species，ROS)。2型半胱氨酸過(guò)氧化物酶（2-Cysteine peroxiredoxin，2-Cys Prx）是一種過(guò)氧化物酶，能夠清除過(guò)氧化物，保護(hù)細(xì)胞免受氧化應(yīng)激。本研究主要利用超表達(dá)和沉默技術(shù)

2、對(duì)糙皮側(cè)耳2-Cys Prx基因功能進(jìn)行初步研究，結(jié)果如下:
　　1、2-Cys Prx基因開(kāi)放式閱讀框?yàn)?29 bp，包含5個(gè)內(nèi)含子，6個(gè)外顯子。其中cDNA序列全長(zhǎng)651 bp，編碼了216個(gè)氨基酸。預(yù)測(cè)的分子量大小和理論等電點(diǎn)分別為23.9 kDa和5.4。預(yù)測(cè)的氨基酸序列具有典型的2-Cys Prx結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，含有兩個(gè)保守的半胱氨酸結(jié)構(gòu)域（Cys48和Cys170）以及GGLG(Gly-Gly-Leu-Gly)和YF(Tyr

3、-Phe)兩個(gè)保守的模體，這兩個(gè)模體能靈敏地識(shí)別H2O2并進(jìn)行信號(hào)傳導(dǎo)。在進(jìn)化關(guān)系上糙皮側(cè)耳的2-Cys Prx基因與雙孢蘑菇距離最近。
　　2、構(gòu)建了2-Cys Prx基因的超表達(dá)載體pCAMBIA1302-OE以及沉默載體pCAMBIA1302-RNAi-1和pCAMBIA1302-RNAi-2，并通過(guò)根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化糙皮側(cè)耳菌絲體，經(jīng)過(guò)PCR驗(yàn)證和綠色熒光蛋白的檢測(cè)表明目的基因已經(jīng)穩(wěn)定插入糙皮側(cè)耳的基因組中，共獲得23個(gè)超

4、表達(dá)轉(zhuǎn)化子，28個(gè)沉默轉(zhuǎn)化子R1，18個(gè)沉默轉(zhuǎn)化子R2，轉(zhuǎn)化效率分別是62％、67％和60％。通過(guò)qRT-PCR分析2-Cys Prx基因在不同的轉(zhuǎn)化子中表達(dá)水平，結(jié)果表明與野生型菌株相比，超表達(dá)轉(zhuǎn)化子中2-Cys Prx基因的最高表達(dá)量可達(dá)3.5倍。沉默轉(zhuǎn)化子R1干擾效率58％，而R2干擾效率為34％。
　　3、研究發(fā)現(xiàn)，超表達(dá)或沉默2-Cys Prx基因?qū)Σ谄?cè)耳的菌絲和菌落形態(tài)均無(wú)明顯影響，非生物逆境脅迫試驗(yàn)顯示，2-Cys