以GFP為報告基因的多基因共表達慢病毒載體系統(tǒng)的構(gòu)建.pdf

1、神經(jīng)細胞的轉(zhuǎn)基因技術(shù)是不僅是研究神經(jīng)系統(tǒng)疾病的分子病理機制的重要手段,而且為神經(jīng)系統(tǒng)疾病的基因治療帶來了新的希望。其關(guān)鍵之一就是選擇良好的轉(zhuǎn)基因載體。近年來慢病毒載體以其獨特的優(yōu)勢而越來越被人們所關(guān)注。慢病毒載體(LV,lentiviral vector)來源于人類免疫缺陷病毒1型(HIV-1),其致病基因已經(jīng)被剔除,它能感染包括神經(jīng)元在內(nèi)的非分裂細胞、感染效率高、免疫原性低,可攜帶轉(zhuǎn)基因整合到宿主細胞基因組內(nèi)而長期穩(wěn)定地表達所攜帶目的

2、基因。因大多數(shù)神經(jīng)系統(tǒng)疾病是由多個基因共同作用所致,故進行基因治療時需要選擇能夠同時上調(diào)(強啟動子驅(qū)動)目的基因或下調(diào)(siRNA基因沉默)多個靶基因的轉(zhuǎn)基因載體。因此當前慢病毒載體研究的一個方向即是構(gòu)建多基因共表達載體。此外,因為慢病毒感染宿主細胞時無明顯的感染標記,故進行滴度測定時極為不便,目前尚缺快速穩(wěn)定的滴度測定方法。
　　針對上述問題,本研究利用分子克隆方法構(gòu)建了一套多基因共表達慢病毒載體構(gòu)建系統(tǒng),此系統(tǒng)可用以構(gòu)建多si

3、RNA、報告基因GFP和目的基因共表達的慢病毒載體?？蓪FP作為感染標記,采用標準的TCID50法計算病毒滴度,建立了一種方便快捷的慢病毒滴度測定方法,為神經(jīng)系統(tǒng)疾病的研究和治療建立了一個實用工具。
　　目的:
　　1.構(gòu)建多個siRNA表達盒,GFP及目的基因共表達的慢病毒載體構(gòu)建系統(tǒng)pLKO-M和pSi-shutle。
　　2.和慢病毒包膜質(zhì)粒與輔助質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細胞產(chǎn)生表達GFP的慢病毒顆粒并建立慢病毒滴度

4、的TCID50快速測定方法。
　　方法:
　　1.現(xiàn)有慢病毒載體pLKO-1-puro的多克隆位點的改建:設(shè)計并合成新的多克隆位點(AgeI、EcoRI、XbaI、SalI和MluI)序列,退火后連接到經(jīng)AgeI和EcoRI雙酶切的pLKO-1-puro載體質(zhì)粒上,形成重組質(zhì)粒pLKO-1-puro-MCS;轉(zhuǎn)化大腸桿菌(escherichia coli,E.coli)DH5α感受態(tài)細胞,篩選陽性菌落、擴增后提取質(zhì)粒,Mlu

5、I和BamHI雙酶切鑒定。
　　2.CMV啟動子-GFP-IRES-MCS元件克隆至pLKO-1-puro-MCS:以pGFP-IRES為模板設(shè)計引物,用高保真DNA聚合酶擴增出約2.4kb片段,XbaI和SalI酶切后克隆至pLKO-1-puro-MCS的XbaI和SalI位點處,XbaI和lSalI酶切鑒定。
　　3.配套質(zhì)粒pSi-shutle的構(gòu)建:設(shè)計INPTEN1和INPTEN2引物,PCR擴增pSilencer

6、2.0,得到421bp片段,將其克隆至pENTR-U6-con,得pSi-shutle,SalI和XbaI酶切鑒定陽性菌落。
　　4.用脂質(zhì)體2000將重組載體質(zhì)粒PLKO-M、輔助質(zhì)粒pCMV-dR8.2 dvpr和包膜質(zhì)粒pCMV-VSV-G共同轉(zhuǎn)染293T細胞,產(chǎn)生具有感染能力的慢病毒顆粒,在25000rpm、4℃條件下離心90min濃縮病毒顆粒。
　　5.TCID50法測定慢病毒滴度:將病毒顆粒進行系列稀釋后感染2個

7、96孔板內(nèi)Vero細胞,48小時后在倒置熒光顯微鏡下計數(shù)產(chǎn)生綠色熒光的孔數(shù)并計算滴度。
　　結(jié)果:
　　1.含新的多克隆位點(MCS)的寡核苷酸鏈被成功克隆到慢病毒載體質(zhì)粒pLKO-1-puro中,得pLKO-1-puro-MCS,經(jīng)過酶切鑒定證明構(gòu)建成功。
　　2.CMV啟動子-GFP-IRES-MCS元件被成功克隆至pLKO-1-puro-MCS,酶切鑒定正確。
　　3.pSilencer2.0質(zhì)粒上的siR

8、NA表達盒被成功克隆至pENTR-u6-con,酶切和測序鑒定正確。
　　4.三質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T48小時后可見GFP表達,72小時后收獲慢病毒顆粒并進行了濃縮。
　　5.將濃縮后的病毒系列稀釋后感染2個96孔板內(nèi)Vero細胞,48小時后出現(xiàn)綠色熒光,用TCID50法計算得出濃縮后的病毒感染單位(IU)均值為6.47X106TU/ml。
　　結(jié)論:
　　1.成功構(gòu)建了siRNA表達盒和GFP-目的基因共表達的慢病