可誘導(dǎo)表達(dá)hBMP-2基因的慢病毒載體的構(gòu)建及其慢病毒的產(chǎn)生和鑒定.pdf

1、目的：構(gòu)建可誘導(dǎo)表達(dá)人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2(hBMP-2)基因的慢病毒載體，轉(zhuǎn)染人胚胎腎上皮細(xì)胞系293FT細(xì)胞獲得相應(yīng)的病毒顆粒，感染并獲得在強力霉素誘導(dǎo)條件下高效表達(dá)hBMP-2的人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞，為下一步可誘導(dǎo)表達(dá)hBMP-2的人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療骨壞死奠定堅實的實驗基礎(chǔ)。
　　 方法：以pcDNA-hBMP-2為模板，采用聚合酶鏈反應(yīng)法擴增前后端帶有attB重組位點的入骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2(hBMP-2)全長序列。利

2、用Gateway載體構(gòu)建技術(shù)，將擴增產(chǎn)物通過BP反應(yīng)克隆至pDown載體中，測序正確后，采用LR重組酶將pDownhBMP-2，pUp-TRE和pLV/Des2-Neo進(jìn)行重組反應(yīng)，構(gòu)建慢病毒載體表達(dá)質(zhì)粒pLV/EXPN2-Neo-TRE-hBMP-2。將pLV/EXPN2-Neo-TRE-hBMP-2與包裝質(zhì)粒(pLV/helper-SL3、pLV/helper-SL4、pLV/helper-SL5)混合，利用脂質(zhì)體共同轉(zhuǎn)染293FT

3、細(xì)胞，包裝攜帶hBMP-2基因的慢病毒顆粒，感染人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞，在強力霉素(doxcycline)誘導(dǎo)下，用ELISA檢測目的細(xì)胞hBMP-2的表達(dá)情況。
　　 結(jié)果：通過酶切、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)及測序驗證可誘導(dǎo)hBMP-2真核表達(dá)慢病毒載體構(gòu)建成功；pLV/EXPN2-Neo-TRE-hBMP-2與包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染包裝細(xì)胞293FT細(xì)胞，成功獲得攜帶hBMP-2基因的慢病毒顆粒，繼之感染人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞，在強力霉素誘導(dǎo)條件下，