用于多模態(tài)分子影像含雙報(bào)告基因的腺病毒載體的構(gòu)建及鑒定.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、目的：構(gòu)建含有由人轉(zhuǎn)鐵蛋白受體基因(TFRC)和螢火蟲熒光素酶基因(Luc)組成的雙報(bào)告基因的重組腺病毒載體(Ad),為磁共振(MR)和生物發(fā)光雙模態(tài)分子成像提供一個(gè)全新的實(shí)驗(yàn)工具。
　　方法：從psiCHECK-2質(zhì)粒中用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增Luc基因,克隆入腺病毒穿梭載體pShuttle-CMV后行NheⅠ/XbaⅠ雙酶切和測序鑒定。然后利用PCR擴(kuò)增TFRC基因,克隆到pShuttle-CMV-CMV-Luc穿梭載體

2、的多克隆位點(diǎn)區(qū),進(jìn)行SfiⅠ酶切和測序鑒定,得到的重組穿梭載體pShuttle-TFRC-Luc再與腺病毒骨架載體(pAdeno)同源重組,然后將XhoⅠ酶切鑒定正確的重組病毒質(zhì)粒經(jīng)293細(xì)胞包裝純化并行PCR鑒定,測定其病毒滴度。用獲得的重組腺病毒Ad-TFRC-Luc感染人結(jié)直腸癌LOVO細(xì)胞,轉(zhuǎn)鐵蛋白受體(TfR)和熒光素酶蛋白的表達(dá)分別用免疫蛋白印跡(western blot)、實(shí)時(shí)熒光定量PCR法和體外生物發(fā)光成像來檢測。

3、r>　　結(jié)果：轉(zhuǎn)鐵蛋白受體基因正確重組到攜帶有熒光素酶基因的腺病毒載體中,測序結(jié)果與GenBank序列完全一致,酶切鑒定結(jié)果顯示均能得到與理論大小相符的2.3kb片段。Ad-TFRC-Luc重組腺病毒構(gòu)建成功,病毒滴度達(dá)1.6×1010pfu/ml,感染LOVO細(xì)胞48小時(shí)后轉(zhuǎn)鐵蛋白受體和熒光素酶蛋白的表達(dá)水平顯著增加,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。
　　結(jié)論：Ad-TFRC-Luc重組腺病毒構(gòu)建成功,可用于下一步的多模態(tài)活

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