急性肺損傷大鼠細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制及地塞米松保護(hù)作用的研究.pdf

1、目的:建立油酸型急性肺損傷(ALI)模型，在此模型基礎(chǔ)上研究急性肺損傷肺組織細(xì)胞凋亡改變及其細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制，探討地塞米松在急性肺損傷早期細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的作用。 方法:(1)復(fù)制動物模型：油酸組(OG組)將SD大鼠尾靜脈注入0.25ml/Kg油酸，而后用1ml生理鹽水沖洗粘附于輸液管內(nèi)的油酸，標(biāo)記后分籠飼養(yǎng)，分別于1h，2h，4h，6h及24h頸總動脈放血處死。對照組(CG組)尾靜脈注入0.25ml/Kg生理鹽水及1ml生理

2、鹽水。地塞米松治療組(DO2h)尾靜脈注入油酸0.25ml/Kg，15min后尾靜脈注入地塞米松1.0mg/Kg，2h處死。(2)觀察各組動脈血?dú)狻⒎瓮ㄍ感灾笜?biāo)及病理變化：各組取動脈血行血?dú)夥治?，測定左肺濕/干比，肺系數(shù)(LI)，Bradford法測支氣管肺泡灌洗液(BALF)蛋白含量及肺通透性指數(shù)(PPI)，顯微鏡下BALF細(xì)胞計(jì)數(shù)，大體病理及顯微病理觀察肺損傷程度。(3)檢測肺組織細(xì)胞凋亡情況：免疫組織化學(xué)方法檢測肺組織細(xì)胞Fas-

3、L蛋白表達(dá)情況。(4)炎性因子的檢測：放射免疫法檢測大鼠血清、肺組織勻漿液及BALF中TNF-α，IL-6水平。(5)細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)系統(tǒng)中相關(guān)蛋白的檢測：免疫印跡法(Westernblotting)和免疫組織化學(xué)方法檢測肺組織磷脂酰肌醇3-激酶(PI3-K)，細(xì)胞外調(diào)節(jié)激酶(ERK)及磷酸化ERK(P-ERK)蛋白表達(dá)情況。 結(jié)果:(1)油酸致傷后動脈血?dú)?、肺通透性改變：尾靜脈注射油酸可以導(dǎo)致大鼠PaO2和SaO2降低，動脈血?dú)?/p>

4、表現(xiàn)為I型呼吸衰竭；OG組左肺濕/干比、LI明顯增加(P＜0.05，P＜0.05)；BALF蛋白含量和PPI明顯增加(P＜0.01，P＜0.05)；BALF細(xì)胞數(shù)明顯增加(P＜0.05)，增加的細(xì)胞以中性粒細(xì)胞為主。油酸組大體及顯微病理表現(xiàn)主要為肺水腫、透明膜形成及肺實(shí)變。(2)ALI時(shí)大鼠肺組織細(xì)胞凋亡水平改變：Fas-L蛋白陽性細(xì)胞主要分布于終末細(xì)支氣管上皮細(xì)胞、肺泡上皮細(xì)胞、肺血管內(nèi)皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，F(xiàn)as-L在對照組大鼠肺組織輕

5、微表達(dá)，而在ALI大鼠肺組織表達(dá)明顯增加，OG組陽性細(xì)胞顆粒數(shù)目及灰度明顯高于CG組(P＜0.05)；Fas-L表達(dá)增加的峰值在油酸致傷后4h，以后維持在較高水平。(3)ALI時(shí)大鼠炎性因子改變：大鼠注入油酸后血清、肺組織勻漿液及BALF中TNF-α含量迅速上升(P＜0.05)，其峰值在血清、肺組織勻漿液及BALF中大致相同，即1h左右達(dá)到高峰，而后逐漸下降。IL-6含量則緩慢升高(P＜0.05)，其峰值在血清、肺組織勻漿液及BALF中

6、也大致相同，4h左右達(dá)到高峰，以后維持在較高水平。(4)ALI時(shí)細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)中相關(guān)蛋白的變化：PI3-K、ERK、P-ERK主要表達(dá)在支氣管、肺泡上皮細(xì)胞、肺血管內(nèi)皮細(xì)胞及肺泡巨噬細(xì)胞上，OG組PI3-K、ERK、P-ERK表達(dá)明顯增高，P＜0.05，其表達(dá)增高的峰值在油酸致傷后1h左右。(5)地塞米松保護(hù)作用的機(jī)制：地塞米松注射后可以提高油酸致傷大鼠的PaO2和SaO2(P＜0.05)并使其肺通透性改善(DO2h組左肺濕/干比、

7、LI、BALF蛋白含量、PPI及BALF細(xì)胞計(jì)數(shù)均小于OG2h組，各項(xiàng)指標(biāo)P＜0.05)，但地塞米松不能使上述各項(xiàng)指標(biāo)恢復(fù)到正常水平(DO2h組與CG組比較，P＜0.05)。地塞米松可以減輕油酸致傷后肺組織終末細(xì)支氣管、肺泡上皮細(xì)胞、肺血管內(nèi)皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的過度凋亡(P＜0.05)，但不能使凋亡水平恢復(fù)正常，P＜0.01。DP2h組血清、肺組織勻漿液及BALF中TNF-α和IL-6較OG2h組降低，高于CG組。地塞米松還可以抑制ALI

8、大鼠PI3-K、ERK活化，使其表達(dá)降低(P＜0.05)，但仍高于正常大鼠(P＜0.05)。 結(jié)論:(1)Fas-L依賴的肺泡上皮細(xì)胞、肺血管內(nèi)皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞凋亡參與早期ALI發(fā)病機(jī)制。(2)ALI時(shí)血清、肺組織勻漿液及BALF中炎性介質(zhì)TNF-α及IL-6水平升高，TNF-α的大量釋放會促進(jìn)肺組織內(nèi)表達(dá)Fas-L的巨噬細(xì)胞、肺泡上皮細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞等凋亡，加重肺損傷。(3)支氣管、肺泡上皮細(xì)胞、肺血管內(nèi)皮細(xì)胞、肺泡巨噬細(xì)胞