應力、電磁刺激對骨骼內(nèi)細胞信號轉(zhuǎn)導及機制研究.pdf

1、骨質(zhì)疏松癥(OP)是最為常見的臨床疾病之一,以骨量下降和骨的微細結(jié)構(gòu)破壞為特征,表現(xiàn)為骨的脆性增加和骨折風險的大大提高。OP的誘發(fā)因素眾多,以衰老、性激素缺乏、應力刺激不足、營養(yǎng)不良、糖尿病所誘發(fā)的OP最為常見。隨著我國人口老齡化速度的加劇,OP給我國帶來的經(jīng)濟和社會負擔也逐年加重。因此,只有對骨骼及其內(nèi)部細胞的生物學特征進行更全面而深入的認識,才能進一步深入了解OP的發(fā)生機制,為臨床治療OP提供更科學而有力的依據(jù)。
　　應力和電

2、磁場是骨骼在日常活動中所承受的最常見的兩種物理因子,它們對于機體的骨骼代謝及骨健康狀態(tài)有著重要的影響。首先,骨骼是機體的應力承載系統(tǒng),它能夠調(diào)整和改變自身的內(nèi)部結(jié)構(gòu)以適應外界應力刺激的變化(Wolff定律)。而骨骼上的應力負荷不足或骨骼自身應力響應能力的衰退是誘發(fā)OP的主要原因之一。但是,骨適應原理的具體機制目前尚不明確。骨是以何種形式將外界的應力信號傳遞至骨骼內(nèi)部的細胞的,骨骼內(nèi)的細胞又是如何感應這些刺激并將其轉(zhuǎn)導為細胞內(nèi)部的生物化學

3、信號的,這些骨力學信號轉(zhuǎn)導研究領域的重要的疑問目前仍不明確。其次,骨骼處于復雜的電磁微環(huán)境中,而外界應力也會在骨骼內(nèi)產(chǎn)生電磁信號的改變(骨骼“壓電效應”),Bassett于1977年首次將外源性的脈沖電磁場（PEMF)引入臨床成功的治療骨不連,并預測外源性的電磁刺激可能作為一種經(jīng)濟、無創(chuàng)、副作用小的物理治療方法用于臨床OP的治療。但是PEMF作用的骨骼內(nèi)的靶細胞是什么,其具體作用的信號通路傳導機制是什么,目前仍不明確。
　　本研究

4、首先以細胞中最重要的第二信使分子—鈣信號作為突破口,發(fā)現(xiàn)了應力刺激下體外骨細胞(OCY)網(wǎng)絡具有獨特的多鈣尖峰鈣信號響應特性,并且OCY網(wǎng)絡的應力敏感性要遠高于成骨細胞(OB),這一發(fā)現(xiàn)為證實OCY網(wǎng)絡是骨骼中感受應力刺激的核心組件提供了有力的依據(jù)。其次,我們對分離培養(yǎng)的脛骨組織進行動態(tài)載荷刺激,觀察原位OCY網(wǎng)絡的鈣信號動力學特征,我們在國際上首次發(fā)現(xiàn)了原位OCY響應應力刺激的多鈣尖峰特性,而骨陷窩—小管系統(tǒng)中的組織液流動是誘發(fā)OCY

5、信號響應的主要內(nèi)在驅(qū)動力,而OCY網(wǎng)絡正是通過組織液流動所誘發(fā)的鈣信號來響應和處理外界的應力刺激的。第三,我們分別構(gòu)建去勢(高骨轉(zhuǎn)換)及胰島素依賴型糖尿病(低骨轉(zhuǎn)換)的OP動物模型,施加外源性的PEMF刺激以觀察其作用效果及相關的機制。PEMF對于兩種因素誘發(fā)的骨丟失都有很顯著的緩解作用, PEMF對于骨形成的促進作用明顯,而對于骨吸收的作用不顯著,而 OB的Wnt/LRP5/β-catenin信號通路則是PEMF發(fā)揮其作用的主要信號通

6、路。該研究不僅極大的豐富了我們對骨骼力學信號轉(zhuǎn)導和電磁信號轉(zhuǎn)導及其機制的認識,并且為應力和電磁刺激在臨床抗OP的應用提供了重要的實驗依據(jù)。整個研究分為以下三個部分:
　　第一部分:流體剪切力誘發(fā)的體外骨細胞網(wǎng)絡鈣信號響應時空動力學特征研究
　　背景:OCY位于充滿組織液的骨陷窩—小管系統(tǒng)(LCS)中,它們憑借獨特的細胞突觸彼此相連形成骨骼內(nèi)廣闊的OCY網(wǎng)絡,科學家們推測這個骨基質(zhì)內(nèi)廣闊的OCY網(wǎng)絡是響應外界力學刺激的主要組件

7、。但是,目前仍未見對于OCY和骨骼中其它細胞(如OB)力學敏感性的系統(tǒng)的比較和研究。
　　方法:采用微接觸壓印和自組裝單分子表面化學技術構(gòu)建體外OCY和OB細胞網(wǎng)絡,細胞表面施加流體剪切力,實時觀察兩種細胞網(wǎng)絡的鈣信號響應;開發(fā)基于獨立成分分析(ICA)的細胞網(wǎng)絡鈣信號自動提取算法提取兩種細胞網(wǎng)絡鈣信號,并基于該算法分析細胞網(wǎng)絡鈣信號時空動力學特征。
　　結(jié)果:流體剪切力誘發(fā)OCY細胞網(wǎng)絡產(chǎn)生獨特的多鈣尖峰鈣信號響應,而大多

8、數(shù)OB主要表現(xiàn)為單一的鈣主峰;同等強度剪切力作用下, OB的鈣響應尖峰數(shù)量顯著低于OCY;OCY和OB的鈣信號時空特征參數(shù)隨應力強度的增加線性增加;OCY細胞網(wǎng)絡與OB細胞網(wǎng)絡在響應和處理應力刺激所表現(xiàn)的鈣信號時空動力學特征顯著不同,OCY細胞網(wǎng)絡比OB細胞網(wǎng)絡具有更顯著的時間域鈣信號振蕩特征和更高的空間域鈣信號相關性和鈣尖峰同步性,且其空間同步性依賴于細胞的間隔距離;相比傳統(tǒng)的手動鈣信號分析法,我們開發(fā)的基于ICA的自動分析算法節(jié)省了

9、巨大的工作量,且準確性更高,該算法具有在鈣信號分析研究領域廣闊的應用前景。
　　結(jié)論:OCY細胞網(wǎng)絡比OB細胞網(wǎng)絡具有更高的應力響應敏感性,最直接的證實了OCY細胞網(wǎng)絡是響應外界力學刺激的核心組件。
　　第二部分:小鼠脛骨周期載荷作用下原位骨細胞鈣信號響應及其作用的相關機制
　　背景:OCY位于獨特的LCS微環(huán)境中,骨是如何將外界應力轉(zhuǎn)為細胞水平的應力信號的,OCY是如何感受力學信號并將其轉(zhuǎn)導為細胞內(nèi)的生物化學信號的,

10、目前仍不得而知。深入探究這些問題,對于更全面、深入的了解OCY力學信號轉(zhuǎn)導和骨適應的機制具有重要的意義。
　　方法:離體培養(yǎng)小鼠脛骨,使用自行開發(fā)的應力加載系統(tǒng)施加生理水平應力,采用激光掃描共聚焦采集和應力加載同步技術實時觀測脛骨內(nèi)OCY鈣信號響應,有限元分析結(jié)合微應變片測量技術測定骨表面的應變變化,熒光漂泊恢復技術結(jié)合計算模型分析骨陷窩—小管系統(tǒng)中液體流速,使用鈣信號通路拮抗劑分析OCY鈣響應的作用機制。
　　結(jié)果:OB具

11、有自發(fā)的鈣信號響應,OCY基本沒有自發(fā)的鈣響應。應力刺激誘發(fā)原位OCY產(chǎn)生多鈣尖峰的鈣信號響應,OB對應力作用不敏感;骨LCS中的液體流速隨應力線性增加,且細胞突觸流速顯著高于細胞體;OCY鈣信號特征參數(shù)與組織間隙液流速線性相關;細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣庫和ATP相關的P2R/PLC/IP3信號通路在OCY鈣信號響應中發(fā)揮主要作用。
　　結(jié)論:外界應力以骨LCS中的間隙組織液流動的形式作用于OCY,OCY網(wǎng)絡通過間隙組織液流動誘發(fā)的獨特的多鈣

12、尖峰鈣信號來響應和處理外界的應力刺激,細胞外ATP及其相關的細胞內(nèi)P2R/PLC/IP3通路是OCY鈣響應最重要的信號通路。該研究揭開了原位OCY力學信號轉(zhuǎn)導的研究序幕,為證實“OCY是骨骼中最主要的應力信號響應元件”這一猜想提供了最直接而有力的證據(jù)。
　　第三部分:脈沖電磁場對骨質(zhì)疏松模型大鼠骨丟失的抑制作用及機制研究
　　背景:骨中細胞的生物學特征受到周圍電磁環(huán)境的影響,而外源性PEMF刺激可以顯著促進骨生成。一些臨床研

13、究表明PEMF能夠抑制OP患者的骨丟失。但PEMF對于OP的作用效果仍缺乏系統(tǒng)的研究,PEMF在骨中的作用靶點及其相關的信號傳導機制目前仍不清楚,這些限制了其科學而廣泛的臨床應用。
　　方法:設計一套多波形輸出的、“3-HelmHolz線圈”電磁場發(fā)生系統(tǒng),分別構(gòu)建去勢和胰島素依賴型糖尿病大鼠OP模型,分別評價大鼠體質(zhì)量、反映骨代謝的血清生物化學指標、骨生物力學強度、骨微觀結(jié)構(gòu)、骨骼中Wnt、Lrp5、β-catenin、RANK

14、L和RANK的mRNA的表達。
　　結(jié)果:PEMF對去勢及糖尿病大鼠骨量丟失及小梁骨微結(jié)構(gòu)衰退具有顯著的抑制作用,并能改善骨的生物力學性能。血清生化指標分析表明,PEMF能夠調(diào)控去勢及糖尿病大鼠的骨生成行為,但對骨吸收的作用不明顯。同時,PEMF能夠顯著提高其骨骼中的Wnt1,LRP5及β-catenin的mRNA水平,但是對RANKL和RANK表達的影響不明顯。
　　結(jié)論:PEMF作為一種經(jīng)濟、無創(chuàng)、副作用小的物理治療方法