急性髓系白血?。∕2a）骨髓細胞的蛋白質組學分析及預后意義.pdf

1、研究背景及目的：盡管目前急性髓系白血病(acutemyeloidleukemia，AML)的治療取得了顯著的進步，但仍有20％～40％的患者經(jīng)標準誘導治療未能達到完全緩解(completeremission，CR)，即使獲得CR的患者，在鞏固化療后仍有70％左右復發(fā)或發(fā)展為難治性急性髓系白血病(refractoryAML)而治療無效死亡。因此，研究復發(fā)/難治AML的早期判斷預后指標成為白血病領域的一個重要的課題。由于蛋白質是生理、病理過

2、程的直接執(zhí)行者，疾病的不同種類和同一疾病的不同分型或分期也必然表達不同的蛋白質，故結合臨床實際研究蛋白質變化更具有實用意義。目前蛋白質組學技術的發(fā)展使用高通量的方法分析細胞蛋白質表達成為現(xiàn)實，并且蛋白質組學技術在白血病領域中也越來越受到重視，主要研究涉及內(nèi)容包括不同類型白血病的差異性研究，白血病細胞系的研究，藥物對白血病細胞作用等方面，但應用該技術研究急性白血病細胞蛋白質組與臨床預后的關系至今尚未見報告。 本文通過比較首次持續(xù)完

3、全緩解(firstcontinuouscompleteremission，CCR1)時間相差顯著的AML-M2a患者誘導治療前及其復發(fā)患者的白血病細胞蛋白質差異表達情況，來探討AML-M2a患者白血病細胞蛋白質組學特征及其在預后中的價值，為進一步研究難治性AML-M2a的早期診斷和設計新的治療方案提供依據(jù)。 方法： 1.研究對象17例初診的AML-M2a患者為2003年10月-2005年5月的住院患者。中位年齡34歲(1

4、6～56歲)，男12例，女5例，全部病例均為原發(fā)性AML，無多系增生異常，在誘導化療前檢查染色體核型正常，外周血WBC＜100×109/L，免疫表型主要表達CD13+CD33+，伴隨表達CD117+或CD14+或CD11b+或CD7+或CD19+，誘導化療方案包括DA、TA、MA和HA，獲緩解后鞏固化療方案包括DA、TA、MA、HA、IA、MEA和IDAra-C，每30～43天鞏固一療程，化療間歇期常規(guī)進行CNS的白血病預防，中位隨訪時

5、間13個月(10～15個月)。17例患者在開始化療前留取骨髓細胞，依據(jù)首次持續(xù)完全緩解(CCR1)時間分組，大于12個月者為A組(11例)，小于6個月者為B組(6例)，B組患者中有3例在復發(fā)時留取的骨髓細胞為C組。A組和B組白血病細胞占有核細胞比例的中位數(shù)為86％(82％～93％)，C組初診和復發(fā)的白血病細胞占有核細胞比例的中位數(shù)為81％(66％～84％)。 2.雙向電泳采用裂解液凍融法提取單個核細胞的全細胞蛋白質，進行雙向電泳

6、，透射掃描凝膠圖像。應用ImageMaster2DEliteV5.0圖像分析軟件進行分析比較，經(jīng)背景消減、蛋白點配比校正與歸一化處理后，根據(jù)蛋白點的體積的變化，來判斷蛋白點表達量的變化，標記出差異蛋白質點。 3.質譜分析挖取其中一些差異相對明顯的蛋白點，進行膠內(nèi)酶切，再對獲得的肽段進行MALDI-TOF-MS質譜分析。 4.蛋白質組數(shù)據(jù)庫查詢對所得的肽質量指紋圖譜進行數(shù)據(jù)庫分析，明確蛋白質的類型及性質。 5.統(tǒng)計

7、學分析應用spss10.0軟件，A組和B組差異點比較采用獨立樣本t檢驗，C組初診和復發(fā)時的差異點比較采用配對樣本t檢驗，檢驗水準為α=0.05，P≤0.05為差異有統(tǒng)計學意義。 結果： 1.雙向電泳過程中每份標本重復3次，獲得較好的重復性。用ImageMaster2DEliteV5.0圖像分析軟件進行分析，將每例患者3張重復膠擬合成1張平均膠，結果顯示A組、B組、C組分別有(851±50)、(834±37)、(841±3

8、1)個蛋白點被檢測，其等電點大都分布在3～10之間，分子量集中在14～43KD之間。以B組中的一例平均膠作為參考圖像，應用ImageMaster2DEliteV5.0軟件設定差異倍數(shù)≥2倍為標準，評價蛋白質表達水平高低。A組與B組比較，A組有15個蛋白點表達水平升高，9個蛋白點表達水平降低；C組誘導治療前和復發(fā)時比較，復發(fā)時有15個蛋白點表達水平升高，4個蛋白點表達水平降低。所有差異蛋白點均具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。 2.

9、通過質譜分析，從選取的A組和B組蛋白差異點中鑒定出6個蛋白質，其名稱為：tubulin-specificchaperoneB，myeloperoxidase，theCHdomainofhumantransgelin-2，glutathioneS-transferas，zincfingerprotein，Glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase。C組初診和復發(fā)時自身對照比較，3個蛋白點得到鑒定，其名稱

10、為：NAD(P)Hdehydrogenase，hypotheticalprotein，HES1。 結論： 1.CCR1相差顯著的AML-M2a患者初診組間白血病細胞的蛋白質存在表達差異，其中tubulin-specificchaperoneB、myeloperoxidase、zincfingerprotein、glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase在CCR1時間大于12個月的AML

11、-M2a患者(A組)中表達增高，其預后較好；theCHdomainofhumantransgelin-2和glutathioneS-transferas在CCR1時間小于6個月的AML-M2a患者(B組)中表達增高，預后較差。鑒定的6個差異蛋白可能與AML-M2a首次持續(xù)完全緩解時間有關，對判斷預后具有一定的價值。 2.CCR1小于6個月的AML-M2a患者初診與復發(fā)時的白血病細胞蛋白質也存在差異，其中NAD(P)Hdehydr