穩(wěn)定消減MK5增強阿霉素誘導(dǎo)肝癌細胞凋亡的研究.pdf

1、肝癌和胰腺癌均為臨床上最常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，它們的惡性程度高、發(fā)展進程快、轉(zhuǎn)移性強、死亡率高。由于肝癌及胰腺癌發(fā)病初期癥狀隱匿、有效的早期檢測方法匱乏，當患者出現(xiàn)明顯癥狀并確診時，病情往往已經(jīng)發(fā)展至中晚期。手術(shù)切除是肝癌及胰腺癌治療的最佳方案，但是在手術(shù)切除方案不能施行的情況下，化學(xué)藥物療法成為了主要的治療手段。
　　阿霉素是臨床常用的肝癌治療藥物，曾被認為是最有效的肝癌化療藥物之一。然而，阿霉素除具有較強的心臟毒性作用外，也

2、面臨著日益嚴重的肝癌細胞耐藥性導(dǎo)致的療效下降的難題。而胰腺癌的5年生存率僅為5％，其中胰腺導(dǎo)管癌約占胰腺癌總數(shù)的75％-92％，因此，胰腺導(dǎo)管癌是胰腺癌研究的重點。尤為突出的是，臨床上專門用于治療胰腺導(dǎo)管癌的藥物相對較少，對其他腫瘤有效的藥物在胰腺導(dǎo)管癌治療中往往難以奏效。
　　本研究的第一部分主要探討MK5在阿霉素誘導(dǎo)的肝癌細胞凋亡中的作用。MAPKAPK5(MK5)，又名p38調(diào)節(jié)/激活的蛋白激酶(p38-regulated/

3、activated proteinkinase，PRAK)。盡管有實驗證據(jù)提示MK5的mRNA水平在正常肝組織與肝癌組織中存在差異，但MK5與肝癌發(fā)生發(fā)展機制的關(guān)系卻并不明確。本研究中，我們首先比較了MK5在人肝癌及其癌旁組織樣本中的蛋白含量，結(jié)果顯示，MK5蛋白在肝癌樣本中呈高豐度表達。隨后，我們采用基因擾動的方式，分別在肝癌細胞株HepG2及Hep3B中構(gòu)建了過量表達MK5的穩(wěn)定細胞株，以及消減內(nèi)源MK5的穩(wěn)定細胞株。結(jié)果顯示，MK

4、5蛋白表達水平的變化對肝癌細胞在正常培養(yǎng)條件下的細胞周期及增殖速率無顯著影響。但是，過量表達MK5能夠提高肝癌細胞在阿霉素處理條件下的存活率，而消減內(nèi)源MK5表達能夠降低阿霉素處理下的肝癌細胞存活率。過量表達或消減內(nèi)源MK5對其他化療藥物（如喜樹堿、長春新堿及紫杉醇）處理條件下肝癌細胞株的存活能力沒有影響。進一步的研究結(jié)果顯示，MK5能夠通過蛋白酶體降解，其過程能夠被阿霉素所促進。此外，過量表達MK5能夠削弱阿霉素誘導(dǎo)的肝癌細胞的凋亡，

5、而消減內(nèi)源MK5能夠增加肝癌細胞對阿霉素處理的敏感性（肝癌細胞凋亡率約增加25％-40％）。
　　本文的第二部分是尋找和探討治療胰腺癌的藥物靶標。腦特異性表達激酶2(Brain-specific kinase2，BRSK2)是AMPK(AMP-activated protein kinase)家族成員之一。本實驗室早期工作證實，BRSK2蛋白在胰腺導(dǎo)管癌細胞PANC-1以及胰腺導(dǎo)管癌組織中高豐度表達，它是PANC-1細胞耐受惡劣環(huán)

6、境（如糖饑餓）的重要因子。因此，BRSK2是潛在的胰腺導(dǎo)管癌治療靶標，而尋找BRSK2調(diào)控機制對胰腺導(dǎo)管癌治療也具有重要意義。本研究中，我們通過酵母雙雜交方式，發(fā)現(xiàn)了一個新的與BRSK2相互作用的蛋白Jab1(c-Jun activation domain-binding protein-1)。據(jù)文獻報道，Jab1能夠促進多個蛋白通過泛素蛋白酶體途徑降解，此外，Jab1也能夠參與細胞周期進程的調(diào)控。我們首先對BRSK2及Jab1在多種腫

7、瘤細胞株中的蛋白表達情況進行了檢測。結(jié)果顯示，Jab1在腫瘤細胞株中廣泛表達，而BRSK2僅在胰腺導(dǎo)管癌PANC-1細胞中高豐度表達，在HeLa細胞及HEK293T細胞中有少量的表達。通過GST pull-down及免疫共沉淀實驗，我們證實了BRSK2與Jab1能夠在體外及生理水平相互結(jié)合。免疫熒光共定位實驗結(jié)果顯示，BRSK2與Jab1在細胞內(nèi)存在共定位現(xiàn)象。我們證實了Jab1能夠提高BRSK2的體內(nèi)泛素化水平并且促進BRSK2蛋白通

8、過蛋白酶體降解。此外，外源表達BRSK2能夠誘導(dǎo)腫瘤細胞周期阻滯在G2/M期，而外源過量表達Jab1可以逆轉(zhuǎn)BRSK2誘導(dǎo)的G2/M期阻滯。
　　綜上所述，我們的研究第一次發(fā)現(xiàn)MK5蛋白在肝癌組織中呈現(xiàn)高豐度表達，我們證實了穩(wěn)定消減MK5能夠增強阿霉素誘導(dǎo)的肝癌細胞凋亡。另一方面，我們發(fā)現(xiàn)了胰腺導(dǎo)管癌中高豐度表達蛋白BRSK2的一個新的互作分子Jab1并證實Jab1能夠促進BRSK2通過蛋白酶體降解。本項研究為肝癌細胞株阿霉素耐藥