水稻RAD21同源基因RIX4的分子特性研究.pdf

1、本論文前期工作中，通過mRNA差別顯示獲得了受白葉枯菌(Xanthomonas oryzae pv.oyzae)誘導表達的差異cDNA片段。國際互連網(wǎng)Blastn查詢表明該基因為新基因。本課題旨在對這一與白葉枯菌抗性相關(guān)的基因進行進一步研究。 應用RT-PCR技術(shù)獲得了該基因完整ORF序列，該序列全長2,187 bp，編碼一個728氨基酸的預測蛋白，分子量約為80.35 KD，等電點為4.65。經(jīng)序列拼接獲得該基因的約5.3kb

2、的基因組DNA序列，將該基因組DNA序列與cDNA序列進行比對分析，發(fā)現(xiàn)RIX4基因含11個外顯子和10個內(nèi)含子，所有10個內(nèi)含子都符合保守的/GT-AG/特征。Blastp分析結(jié)果表明，RIX4蛋白在N末端含Pfam04825，在C末端含Pfam04824保守結(jié)構(gòu)域，這兩個保守結(jié)構(gòu)域在RAD21/REC8類蛋白中很保守，表明RIX4蛋白屬于RAD21/REC8類粘合蛋白。其蛋白的二級結(jié)構(gòu)由21.98％a-螺旋，7.01％延伸和71.0

3、2％隨意卷曲三種結(jié)構(gòu)模塊組成。 在不育系和保持系水稻花粉母細胞減數(shù)分裂期幼穗中得到了RIX4基因另一轉(zhuǎn)錄本RIX4-5片段。對RIX4基因的5個轉(zhuǎn)錄本進行了序列和剪接模式的分析，結(jié)果表明第6和第7外顯子序列的選擇性剪接模式屬于常見的選擇外顯子上不同的5’或3’剪接位點進行選擇性剪接的模式，而第6和9外顯子上序列的選擇性剪接模式不符合常見的7種剪接模式，是一種新的剪接模式。稻瘟病菌的侵染有利于RIX4基因前體mRNA剪接形成RIX

4、4-1轉(zhuǎn)錄本，白葉枯病菌的侵染有利于RIX4基因前體mRNA剪接形成RIX4-4轉(zhuǎn)錄本。 運用大腸桿菌原核表達系統(tǒng)表達出RIX4多肽，并通過免疫新西蘭大白兔制備了多克隆抗體，以此抗體檢測了植物體內(nèi)RIX4蛋白的含量。在受病原菌CR3誘導的水稻IR26愈傷組織中，在誘導0～60 min的水稻愈傷組織中均能檢測到RIX4基因編碼的全長蛋白，而且隨著誘導時間的延長，檢測到的蛋白量增多。在處于花粉母細胞減數(shù)分裂旺盛期的不育系和保持系的幼

5、穗中，保持系中RIX4蛋白含量均高于不育系。在受白葉枯菌CR3侵染不同時期的IR26愈傷組織和不育系及保持系幼穗中僅能檢測到RIX4基因的全長蛋白，而檢測不到其它轉(zhuǎn)錄本所編碼的蛋白。在受稻瘟菌生理小種ZB15(2001-046)誘導的近等基因系H7R和H7S的葉片及生理小種01-14誘導的嘉興02-03和中早27的葉片中，RIX4蛋白含量會隨著誘導時間的變化而變化，在不同的水稻品系中變化趨勢不同，但在受稻瘟菌誘導的水稻葉片中均能檢測到全

6、長蛋白和RIX4-4轉(zhuǎn)錄本所編碼的蛋白，在蛋白水平上證明了RIX4基因存在不同的轉(zhuǎn)錄本。 構(gòu)建了RIX4基因RNA干涉表達載體，通過基因槍法對水稻粳稻品種中花¨進行轉(zhuǎn)化，獲得9株轉(zhuǎn)pCAMBIA-HANNIBAL-RIX4(461)質(zhì)粒的轉(zhuǎn)基因植株和12株轉(zhuǎn)pCAMBIA-HANNIBAL-RIX4(397)質(zhì)粒的轉(zhuǎn)基因植株。對轉(zhuǎn)正義RIX4基因的轉(zhuǎn)基因水稻與轉(zhuǎn)反義RIX4基因的轉(zhuǎn)基因水稻進行的抗病性測定表明，轉(zhuǎn)正義RIX4基因

7、的轉(zhuǎn)基因水稻可以增強對白葉枯菌的抗性，而轉(zhuǎn)反義RIX4基因的轉(zhuǎn)基因水稻降低了對白葉枯菌的抗性，表明RIX4基因是一個抗白葉枯病菌相關(guān)基因。 采用含3328個基因的cDNA陣列，分析了水稻光溫敏核不育系培矮64S于長日照/高溫及短日照/低溫下幼穗的基因表達譜特征。統(tǒng)計數(shù)據(jù)表明，以短日照/低溫(花粉可育)為參比，長日照/高溫(花粉不育)下表達豐度顯著變化的基因高達14.60％，但RIX4基因的表達豐度變化不明顯。相對于482個基因下

8、調(diào)表達，僅4個基因上調(diào)表達，以實時熒光定量PCR技術(shù)對所有上調(diào)表達基因和隨機選擇的9個下調(diào)表達基因進行了檢測，各基因表達豐度的變化趨勢一致，驗證了cDNA陣列雜交結(jié)果的可靠性。這些差異表達基因幾乎涉及所有的細胞生物學反應，同為MAPK同系物的MMK1和MMK2在mRNA水平表現(xiàn)出截然不同的基因表達特征，大量參與信號傳導的信號分子的表達豐度也發(fā)生明顯變化。針對這一結(jié)果，本文提出一種可能的解釋，即花粉形態(tài)建成及相應的生理功能所需要的程序性轉(zhuǎn)