水稻MGD同源基因的克隆及功能研究.pdf

1、高等植物中，單半乳糖甘油二酯(MGDG)和雙半乳糖甘油二酯(DGDG)是組成葉綠體中光合膜的主要膜脂類型，其中MGDG是DGDG合成的前體，因而MGDG的合成在植物的正常生長發(fā)育中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。單半乳糖甘油二酯合成酶(MGD)是合成MGDG的關(guān)鍵酶。目前對MGD的研究多集中在雙子葉植物尤其是模式植物擬南芥，而對單子葉植物中MGD的類型和功能研究相對較少。為了研究單子葉植物中MGD的類型以及功能，本研究以單子葉模式植物粳稻品種日本

2、晴為研究材料，通過RACE法分離并克隆出三個OsMGD基因，通過生物信息學(xué)軟件對OsMGD同源基因的類型、亞細胞定位以及功能進行初步預(yù)測分析，并構(gòu)建過表達載體轉(zhuǎn)入煙草來研究水稻MGD同源基因在植株生長以及低磷脅迫下的功能和作用機制。主要獲得以下結(jié)果:
　　(1)通過NCBI數(shù)據(jù)庫中在線工具Blast，利用擬南芥以及秈稻中的MGD基因序列，在粳稻品種日本晴中，共Blast到三個MGD基因的部分序列，通過RACE法分離并克隆這三個Os

3、MGD基因，分別為OsMGD/02g、OsMGD/08g、OsMGD/09g。通過對多種植物中MGD氨基酸序列進行比對，并構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，發(fā)現(xiàn)OsMGD/02g與擬南芥MGD2和MGD3在同一進化分枝，則OsMGD/02g初步預(yù)測為Type B型MGD;OsMGD/09g則與擬南芥MGD1在同一進化分枝，初步預(yù)測為Type A型MGD;而OsMGD/08g隸屬另一進化分枝，與上述兩種Type類型的進化距離較遠，且此進化分枝中均為單子葉植

4、物MGD，因此初步推測OsMGD/08g隸屬于單子葉植物特有的新類型MGD。另外通過生物信息學(xué)軟件分別對三個OsMGD的跨膜結(jié)構(gòu)、亞細胞定位以及啟動子區(qū)順式作用元件進行預(yù)測分析，發(fā)現(xiàn)這三個OsMGD蛋白都是親水性蛋白，且均不含有跨膜區(qū)域，OsMGD/02g和OsMGD/09g定位于葉綠體，而OsMGD/08g定位于線粒體。分析這三個OsMGD基因啟動子順式作用元件發(fā)現(xiàn)這三個基因啟動子區(qū)均存在與逆境脅迫相關(guān)的順式作用元件。
　　(2

5、)利用半定量RT-PCR分別檢測三個OsMGD基因在不同水稻組織中的表達，發(fā)現(xiàn)OsMGD/02g和OsMGD/09g均在葉和莖中表達量較高，在根和花中表達量較低;而OsMGD/08g則是在葉、根、莖、花中的表達量都很低。隨后對這三個基因在低磷脅迫、干旱脅迫以及鹽脅迫下葉和根中的表達量進行檢測，發(fā)現(xiàn)無論在低磷脅迫、干旱脅迫還是鹽脅迫時，葉中OsMGD/02g表達量都是先升高后降低，根中OsMGD/02g的表達量則是持續(xù)升高;而OsMGD/

6、08g只有在低磷脅迫時會強烈誘導(dǎo)表達;在水稻葉中，OsMGD/09g在不同的脅迫下表達量變化不同，而在水稻根中，OsMGD/09g的表達并不受這三種脅迫影響。通過對三個OsMGD在不同組織以及不同逆境脅迫下的表達模式分析，初步證實系統(tǒng)進化樹對這三個OsMGD的Type分類。
　　(3)利用Gateway法構(gòu)建三個OsMGD基因的植物表達載體，并通過葉盤法完成煙草轉(zhuǎn)化工作。通過潮霉素的篩選，轉(zhuǎn)基因煙草幼苗基因組DNA的PCR檢測，以

7、及定量qRT-PCR檢測目的基因的表達，各篩選3個轉(zhuǎn)基因煙草株系，結(jié)合野生型煙草進行盆栽實驗對轉(zhuǎn)基因煙草進行表型分析。在正常條件下與野生型煙草相比，不同OsMGD基因超表達均提高了煙草中的葉綠素含量和類胡蘿卜素含量，增強了凈光合速率，進而增加了轉(zhuǎn)基因煙草的生長速率，提高了煙草的葉鮮重，從而使得轉(zhuǎn)OsMGD煙草的長勢較好。
　　(4)為了研究OsMGD同源基因在低磷脅迫下的功能和作用機制，通過盆栽實驗，對轉(zhuǎn)基因和野生型煙草進行低磷脅

8、迫處理。與野生型煙草相比，低磷處理后三個OsMGD基因超表達煙草老葉上的壞死斑明顯較少且沒有野生型煙草壞死斑嚴重，而且轉(zhuǎn)基因煙草在低磷脅迫下的葉綠素含量、凈光合速率均顯著高于野生型煙草，葉綠素?zé)晒鈪?shù)Fv/Fm、ΦPSⅡ以及ETR在轉(zhuǎn)基因煙草中的下降幅度相較與野生型SR1較小，說明OsMGD同源基因超表達后緩解了低磷脅迫對煙草植株的傷害，轉(zhuǎn)基因煙草的耐低磷能力提高。
　　(5)利用氣相色譜對低磷脅迫下煙草老葉中脂質(zhì)組分進行測定，發(fā)

9、現(xiàn)低磷處理后，與野生型煙草相比，轉(zhuǎn)基因煙草中MGDG含量均顯著高于野生型SR1，且轉(zhuǎn)基因煙草中DGDG的上升幅度更大，說明低磷脅迫下，OsMGD同源基因超表達煙草中增強了MGDG和DGDG的合成。本研究中低磷處理后野生型煙草和轉(zhuǎn)基因煙草中的磷脂含量均顯著降低，但在低磷脅迫下，相對于野生型SR1，轉(zhuǎn)基因煙草中磷脂的下降幅度更小。另外，計算GL/PL以及DGDG/MGDG的比值后發(fā)現(xiàn)，超表達OsMGD同源基因煙草在低磷脅迫下具有較高的GL/

10、PL和DGDG/MGDG，表明有更多的可以形成雙層膜的DGDG轉(zhuǎn)移到質(zhì)體外膜來替代缺失的磷脂，從而維持膜的完整性和穩(wěn)定性。因此，通過調(diào)控半乳糖脂的合成能力加強了低磷脅迫下的脂質(zhì)重塑，然后維持膜結(jié)構(gòu)的完整以及穩(wěn)定，進而維持葉綠體以及其他亞細胞器的結(jié)構(gòu)和功能，緩解低磷脅迫對植物造成的傷害，從而提高植物對低磷脅迫的抗性。
　　(6)通過比較OsMGD/02g、OsMGD/08g以及OsMGD/09g基因超表達煙草在低磷脅迫下的生理指標以

11、及脂質(zhì)組分變化，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)OsMGD/08g基因煙草對低磷脅迫的耐受性更強，其次是轉(zhuǎn)OsMGD/02g基因煙草。OsMGD/08g可能是在長時間低磷脅迫時發(fā)揮作用，且很可能是低磷脅迫誘導(dǎo)OsMGD/08g基因表達后直接在線粒體膜上利用磷脂降解代謝物二?；视王?DAG)作為底物催化合成MGDG，并通過線粒體上可能存在的雙半乳糖甘油二酯合成酶(DGD)合成DGDG，直接在線粒體膜上替代減少的磷酯，從而維持膜的完整性和穩(wěn)定性。而預(yù)測為Type