水稻RAD21-REC8家族基因的分離與功能分析.pdf

1、染色體黏著是有絲分裂和減數(shù)分裂的關(guān)鍵事件，是保證姊妹(或同源)染色體正確分離并分配到子細(xì)胞中的關(guān)鍵調(diào)控環(huán)節(jié)之一，它建立于細(xì)胞分裂前的S期將新復(fù)制的姊妹染色體緊密聯(lián)系在一起。來自酵母的研究結(jié)果已經(jīng)證明姊妹染色體之間的黏著是由多亞基的蛋白質(zhì)復(fù)合體-黏著素所介導(dǎo)的。在芽殖酵母有絲分裂中，黏著素由Scc1，Scc3，Smc1和Smc3四個亞基組成。減數(shù)分裂黏著素的組成與有絲分裂中的相似，只是Scc1被其減數(shù)分裂特異的Rec8變體所替換。目前，已

2、經(jīng)從高等真核生物線蟲，果蠅，人，鼠以及擬南芥中分離到了黏著素相關(guān)的基因，但是對于這些基因在高等真核生物特別是植物細(xì)胞分裂中的功能還知之甚少。即使在酵母中人們對于減數(shù)分裂和有絲分裂過程中有關(guān)染色體黏著與分離的許多基本問題仍然不清楚，而且許多現(xiàn)象表明減數(shù)分裂的詳細(xì)機制在各種生物中存在重大差異。
　　 我們通過同源克隆的方法證明水稻(和擬南芥)基因組編碼4個RAD21/REC8-like基因。這4個基因均以單拷貝存在，在核苷酸水平上沒

3、有相似性。它們所編碼的蛋白質(zhì)的相似性主要局限于其N-末端結(jié)構(gòu)域和C-末端結(jié)構(gòu)域。這4個蛋白質(zhì)的中間區(qū)域沒有(或者僅有極低的)相似性，但是中間區(qū)域都含有潛在的核定位信號，PEST序列，分離酶的識別序列以及多個磷酸化位點。
　　 半定量RT-PCR，原位雜交以及Western雜交結(jié)果顯示這4個基因都在生殖器官中優(yōu)勢表達，但是它們在花發(fā)育過程中的表達動態(tài)是不同的。OsRAD21-1和OsRAD21-3都在減數(shù)分裂時期的穎花中表達量最高

4、，但是OsRAD21-3還在成熟花粉中高表達；OsRAD21-4在減數(shù)分裂前的穎花中表達量最高；OsRAD21-2則在雌雄蕊形成時期表達最強，之后逐漸降低。這些結(jié)果暗示這4個基因的功能可能是不同的。
　　 免疫熒光定位分析表明，OsRad21-1和OsRad21-3特異地定位于有絲分裂的染色體上，其分布動態(tài)表明這兩個蛋白可能都參與了有絲分裂姊妹染色體之間的黏著。由于水稻四個RAD21/REC8類基因中，只有OsRAD21-3在花

5、粉發(fā)育過程中表達，同時水稻花粉的發(fā)育成熟要經(jīng)過兩次有絲分裂，推測OsRad21-3蛋白可能參與這兩次有絲分裂過程姊妹染色體之間的黏著。OsRad21-4則特異地定位于減數(shù)分裂前間期到中期Ⅰ的染色體上，說明它可能特異地介導(dǎo)減數(shù)分裂過程姊妹染色體之間的黏著。與其它已知的Rad21/Rec8-like蛋白不同，不論在有絲分裂還是在減數(shù)分裂過程中，OsRad21-2蛋白都不定位于染色體上而是特異地定位在核仁中，并且它的動態(tài)變化與核仁重建和解體的

6、動態(tài)規(guī)律在時間上也是相一致的，這說明OsRad21-2是一種新的核仁蛋白質(zhì)而與染色體的黏著無關(guān)。
　　 OsRAD21-4 RNAi轉(zhuǎn)基因水稻植株的花粉活性受到嚴(yán)重影響，種子結(jié)實率降低。雄性減數(shù)分裂過程中染色體出現(xiàn)多種異常行為：前期Ⅰ染色體異常凝集；同源染色體提早分離；染色體出現(xiàn)片斷化。進一步的FISH實驗結(jié)果證明RNAi株系中同源染色體配對和姊妹染色體臂的黏著均發(fā)生異常。因此，OsRad21-4是酵母Rec8的同源蛋白，是正確