刺萼龍葵種子萌發(fā)相關(guān)的甘露聚糖酶基因的克隆及表達研究.pdf

1、刺萼龍葵是原產(chǎn)北美的有毒有害入侵雜草，由于其適應(yīng)性廣、競爭能力強等特點在我國許多地區(qū)擴散定植，嚴(yán)重破壞了入侵地的生物多樣性。種子是雜草發(fā)生危害和傳播擴散的根源，刺萼龍葵種子具有休眠特性，不利于種群的集中防控和徹底根除。為了探究刺萼龍葵種子休眠萌發(fā)的分子調(diào)控機制，本研究針對種子萌發(fā)過程中降解胚乳組織的關(guān)鍵酶——甘露聚糖酶，克隆了甘露聚糖酶家族的2個基因SrMAN1和SrMAN2，在轉(zhuǎn)錄水平上檢測了外源激素作用下種子在浸種和萌發(fā)過程中的基因

2、表達變化，進行了目的基因的原核表達，并采用凝膠擴散法驗證了重組蛋白的功能。主要研究結(jié)果如下：
　　1.從刺萼龍葵中克隆得到兩個β-甘露聚糖酶相關(guān)基因，其中 SrMAN1基因全長1921 bp， SrMAN2基因全長3075 bp。SrMAN1基因的編碼序列為1143 bp，編碼380個氨基酸，蛋白分子量為42.9 kD，等電點為5.4。SrMAN2基因的編碼序列為1242 bp，編碼413個氨基酸，蛋白分子量為46.6 kD，等電

3、點為5.2。
　　2.實時熒光定量PCR分析表明，赤霉素處理下，SrMAN1和SrMAN2基因均在胚根伸長約10 mm，胚軸露出約2 mm時達到表達高峰。隨著種子吸水時間的延長，脫落酸作用下兩個基因的相對表達量較低；而在赤霉素與清水處理下，兩個基因的表達量先升高再降低，并且赤霉素使兩個基因的表達高峰提前出現(xiàn)；赤霉素處理下，SrMAN1基因的表達高峰高于清水處理下的表達高峰，SrMAN2基因的表達高峰低于清水處理下的表達高峰。SrM

4、AN1和SrMAN2基因在刺萼龍葵種子萌發(fā)前后均有表達，其表達無顯著的組織特異性和時間特異性。赤霉素可在一定程度上影響SrMAN1和SrMAN2基因的表達，但相比于SrMAN1基因，赤霉素對SrMAN2基因的作用較弱。
　　3.成功構(gòu)建了 SrMAN1和 SrMAN2基因的重組表達載體 pET-32a-SrMAN1和pET-32a-SrMAN2，實現(xiàn)了在E. coli BL21(DE3)中的誘導(dǎo)表達。菌液SDS-PAGE表明，Sr