血管緊張素Ⅱ?qū)π募〕衫w維細(xì)胞增殖和膠原合成的影響及其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制的研究.pdf

1、目的：心血管病時(shí)血流動(dòng)力學(xué)改變伴隨著神經(jīng)內(nèi)分泌異常，參與心肌細(xì)胞(CMs)肥大、間質(zhì)增生，導(dǎo)致心室肥大和心室腔擴(kuò)大，即心室重構(gòu)的過(guò)程。心室重構(gòu)是心血管病重要的病理生理過(guò)程。了解心室重構(gòu)的發(fā)病機(jī)理和防治心室重構(gòu)已成為國(guó)內(nèi)外學(xué)者研究的熱點(diǎn)課題。心肌成纖維細(xì)胞(MFs)是心臟中數(shù)量最多且主要合成、分泌心臟細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的細(xì)胞類型。膠原過(guò)度增生、沉積導(dǎo)致心肌纖維化可能是心室重構(gòu)的主要病理基礎(chǔ)。在心室重構(gòu)過(guò)程中，腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)

2、(RAS)在其中起著極為重要的作用，血管緊張素Ⅱ(Ang Ⅱ)作為RAS最為重要的效應(yīng)分子，具有眾多的生物學(xué)活性，與心室重構(gòu)密切相關(guān)，可引起MFs的增生和心臟間質(zhì)纖維化，心肌肥厚中進(jìn)行性加重的間質(zhì)改建是造成肥厚心肌舒縮功能障礙的重要因素。但AngⅡ?qū)Fs增殖及膠原合成的影響及其機(jī)制尚不清楚。 本實(shí)驗(yàn)通過(guò)體外原代提純培養(yǎng)乳大鼠(1-3d)MFs，研究AngⅡ?qū)Fs增殖、膠原分泌量及蛋白激酶C(PKC)亞型ε和α表達(dá)及轉(zhuǎn)位的影響

3、，了解Ang Ⅱ的促增殖和膠原合成作用及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制，從而在細(xì)胞和分子水平上為心肌纖維化發(fā)生機(jī)制提供新的理論依據(jù)，也為防治心室重構(gòu)開辟新的途徑。 方法：本研究以差速貼壁法原代分離提純培養(yǎng)的SD乳鼠MFs為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，DAB免疫組化法鑒定后傳代培養(yǎng)，取第2-4代MFs分實(shí)驗(yàn)組(加AngⅡ 10-6mol/L)和對(duì)照組(不加Ang Ⅱ)培養(yǎng)；四氮唑鹽(MTT)比色法檢測(cè)MFs的增殖；羥脯氨酸測(cè)試盒檢測(cè)MFs膠原合成量；間接免疫熒光法觀

4、察PKC亞型ε和α在細(xì)胞內(nèi)的分布和定位，Image-pro-plus4.0版專業(yè)圖像處理軟件對(duì)熒光強(qiáng)度進(jìn)行半定量統(tǒng)計(jì)。 結(jié)果： 1．差速貼壁90分鐘后分離提純的MFs傳代培養(yǎng)2-4代后，倒置相差顯微鏡下觀察：細(xì)胞呈梭形，多角形，漩渦放射狀生長(zhǎng)。經(jīng)波形蛋白單克隆抗體DAB免疫組化染色后見(jiàn)到細(xì)胞中有棕褐色的，與細(xì)胞長(zhǎng)軸平行的絲狀物，證實(shí)為MFs； 2．在106mol/L Ang Ⅱ作用下，MFs的A值較對(duì)照組的值明顯

5、增加，并且有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)； 3．在106mol/L Ang Ⅱ作用下，MFs培養(yǎng)上清羥脯氨酸含量較對(duì)照組的值明顯增加，并且有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)； 4．實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組熒光顯微鏡下初步觀察PKC亞型ε和α的表達(dá)和轉(zhuǎn)位比較：對(duì)照組PKC亞型ε存在于膜、胞漿和核-細(xì)胞骨架所有三個(gè)部分，但都比較弱，而實(shí)驗(yàn)組PKC亞型ε在膜、胞漿和核-細(xì)胞骨架三個(gè)部分強(qiáng)度明顯增強(qiáng)，尤以核-細(xì)胞骨架為甚；對(duì)照組PKC

6、亞型α主要存在于核-細(xì)胞骨架，而實(shí)驗(yàn)組PKC亞型α在膜、胞漿和核-細(xì)胞骨架三個(gè)部分強(qiáng)度都明顯增加，尤以核-細(xì)胞骨架為甚；且PKC亞型ε和α熒光強(qiáng)度半定量比較實(shí)驗(yàn)組均顯著高于對(duì)照組(P<0.001)。 結(jié)論： 1．在10-6mol/L Ang Ⅱ作用下，MFs數(shù)目增多，提示Ang Ⅱ具有促進(jìn)MFs細(xì)胞增殖的作用； 2．在10-6mol/L Ang Ⅱ作用下，MFs培養(yǎng)上清羥脯氨酸含量明顯增加，這提示Ang Ⅱ具有促