血脂康對新生大鼠心肌成纖維細胞增殖和膠原合成的影響及可能分子機制.pdf

1、在許多心血管疾病發(fā)生時,由于心肌負荷過重、缺血、缺氧和炎癥等原因常常會引起心肌纖維化的形成.心肌纖維化會降低心室壁的順應性使心肌僵硬度增加而引起心室舒張功能障礙.心肌組織電興奮的離散度增加而易引起室性心律失常的發(fā)生；并可影響影響心肌細胞對氧和營養(yǎng)物質(zhì)的攝取和心肌細胞能量的產(chǎn)生,是難治性心衰的組織病理基礎,已成為目前醫(yī)學研究的熱點.心肌纖維化的成因主要是心肌成纖維細胞(cardiacfibroblasts,CFs)的活化、增殖及其所分泌的

2、膠原增生與沉積,CFs的增殖特性和功能改變是心肌纖維化的決定因素。 他汀類藥物系HMG-CoA還原酶抑制劑,是治療血脂異常的有效藥物,除此之外,近期臨床實驗證實他汀類藥物可減輕左室質(zhì)量；洛伐他汀可抑制血管緊張素Ⅱ(angiotensin Ⅱ,AⅡ)誘導的體外培養(yǎng)新生大鼠心肌細胞的肥大；阿托伐他汀可抑制CFs的增殖和膠原合成.血脂康為調(diào)節(jié)異常血脂的中藥,是由特制紅曲在特殊的工藝條件下發(fā)酵精制而成,化學組成比較復雜,有多種有效成分:

3、除明顯的降脂療效外,有研究顯示血脂康可改善高血壓患者的心室舒張功能,與安慰劑組比較,左心室肥厚的發(fā)展程度延緩,提示血脂康可延緩壓力負荷性左心室重塑,為更好地臨床應用血脂康提供了新的視角.本研究以體外原代培養(yǎng)CFs為模型,進一步研究血脂康對心肌纖維化的影響,探討了血脂康抑制CFs增殖和膠原合成的效果及其信號通路調(diào)節(jié)機制,為預防和逆轉(zhuǎn)心肌纖維化提供實驗和理論依據(jù),并觀察了其對原發(fā)性高血壓病患者左室舒張功能和心率變異性的影響,為更好使用血脂康

4、提供理論依據(jù)。 第一部分:心肌纖維化細胞培養(yǎng)模型的建立 目的:CFs是心肌纖維化的主要效應細胞,在心肌細胞外基質(zhì)(ECM)的形成中起重要作用.其增殖特性和功能的改變是心肌結(jié)構(gòu)改變的決定因素.AngⅡ具有生長因子的作用,有上調(diào)細胞因子、促進細胞增生和調(diào)節(jié)細胞外基質(zhì)代謝等作用,本實驗中,我們建立了新生大鼠CFs的原代細胞培養(yǎng),觀察了AngⅡ處理對心肌成纖維細胞增殖的影響,建立了心肌纖維化的細胞培養(yǎng)模型,為開展藥物對CFs增殖

5、影響的實驗提供可靠保證。 方法:心肌成纖維細胞原代培養(yǎng)采用胰蛋白酶消化及差速貼壁法.培養(yǎng)至細胞層融合后,用0.25％胰蛋白酶消化傳代,第2～3代細胞用于實驗。通過細胞形態(tài)觀察和免疫組織化學染色鑒定心肌成纖維細胞純度；臺盼藍染色檢測細胞活性；噻唑藍比色法(MIT法)檢測心肌成纖維細胞增殖；采用SPSS 10.0軟件進行統(tǒng)計學分析。 結(jié)果:顯微鏡下觀察可見原代培養(yǎng)的CFS呈不規(guī)則三角形,胞質(zhì)淡而幾乎透明,折光弱,細胞核較大,

6、呈橢圓形,通常含2～3個核,無自發(fā)性搏動.臺盼藍染色活細胞數(shù)大于97％.免疫細胞化學染色纖維連接蛋白染色呈陽性,波形蛋白染色呈陽性,血管平滑肌肌動蛋白染色呈陰性,PBS對照呈陰性,符合成纖維細胞的染色特征,鑒定為所需的CFS,純度達98％。 MTT法測定AngⅡ?qū)π募〕衫w維細胞增殖的影響,結(jié)果可見,濃度為10-8mol/L,10-7mol/L,10-6mol/L和10-5mol/L的AngⅡ促進了心肌成纖維細胞的增生,此作用呈濃

7、度依賴性,與正常對照組比較p<0.05,其中以10-6mol/L時OD值最大,差異十分顯著,以AngⅡ濃度為10-6mol/L作用于CFs 24 h,48 h,72h,CFs增殖呈時間依賴性,選取48h為AngⅡ作用時間以確保藥物作用充分。 結(jié)論:上述結(jié)果顯示,通過胰酶消化、差速貼壁法可獲高純度的新生大鼠原代培養(yǎng)CFs；.AngⅡ在濃度為10-6mol/L時可促進心肌成纖維細胞增殖,選取48h為AngⅡ作用時間.此系統(tǒng)可作為心肌

8、纖維化研究的細胞培養(yǎng)模型,用于藥物對CFs增殖影響的實驗研究。 第二部分:血脂康對血管緊張素Ⅱ誘導新生大鼠心肌成纖維細胞增殖的影響 目的:他汀類藥物可抑制Ang Ⅱ誘導的大鼠心肌細胞的肥大,且對醛固酮誘導的大鼠心肌成纖維細胞增殖有拮抗作用.血脂康中含有的Monacolins,該藥是否也具抑制心肌纖維化的作用尚未見報道,本實驗觀察了血脂康對心肌成纖維細胞增殖及TGF-β1表達的影響,以期從細胞水平上探索血脂康是否具有預防和

9、逆轉(zhuǎn)心肌纖維化的作用；并探討其可能機制。 方法:實驗采用上述心肌纖維化細胞培養(yǎng)模型,將第二代心臟成纖維細胞調(diào)整濃度為5×104細胞/m1,接種于培養(yǎng)板.待細胞生長至80％融合時,吸去原培養(yǎng)液,PBS洗滌2次,按分組不同分別加入不同刺激因素:(1)對照組:含10％胎牛血清的DMEM；(2)AngII組:AngII 10-6mol.L-1+含10％胎牛血清的DMEM；(3)AngII 10-6mol.L-1+血脂康30ug.ml-1

10、+含10％胎牛血清的DMEM；(4)AngII 10-6mol.L-1+血脂康150 ug.ml-1+含10％胎牛血清的DMEM；(5)AngII 10-6mol.L-1+血脂康750 ug.ml-1+含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)48 h后,用0.25％胰蛋白酶消化至細胞分離,收集各孔細胞,臺盼藍染色血細胞計數(shù)板上進行活細胞計數(shù)或MTT法檢測CFs增殖情況:細胞周期分析也于處理48 h后進行,采用碘化丙啶(PI)染色,在流式細胞儀檢測

11、,Modfit軟件分析細胞周期；血脂康對CFs分泌TGF-β1蛋白的影響采用ELISA法測定,按試劑盒說明方法進行,用酶聯(lián)免疫檢測儀測450 nm波長A值.根據(jù)標準曲線,計算TGF-β1濃度；化學比色法測定血脂康對CFs LDH活性的影響,按試劑盒說明方法進行。 結(jié)果:用細胞計數(shù)法測定血脂康對AngII誘導的CFs增殖的影響,結(jié)果可見:AngII在濃度為10-6mol刺激CFs增殖,不同濃度的血脂康組細胞數(shù)均有不同程度的下降,并

12、隨濃度增加細胞數(shù)下降更明顯,呈劑量依賴性,與AngII組相比,差異有顯著性(P<0.01)；表明血脂康對AngII刺激的心肌成纖維細胞增殖具有明顯的抑制作用；用MTT比色法測定血脂康對CFs增殖的影響,所獲結(jié)果與細胞計數(shù)法基本一致.流式細胞儀測定血脂康對CFs細胞周期的影響:發(fā)現(xiàn)加入AngII后,心肌成纖維細胞G0/G1期細胞百分比F降,S期、G2/M期細胞百分比升高；血脂康組G0/G1期細胞百分比顯著高于AngII組,而S期、G2/M

13、期細胞百分比明顯低于AngII組,且呈劑量依賴關系:表明血脂康具有阻止AngII的刺激細胞進入增殖周期的作用.用ELISA法測定細胞培養(yǎng)上清的TGF-β1含量,與無血清DMEM對照組相比,Ang II(10-6mol.L-1)能明顯增加心肌成纖維細胞培養(yǎng)液中的TGF-β1含量,血脂康能阻斷AngII的這種作用(P<0.01).化學比色法測定了細胞培養(yǎng)上清液LDH活性,血脂康在30～750 ug.ml-1對細胞作用72h,LDH活性無顯著

14、性差異。 結(jié)論:本研究顯示血脂康具有抑制AngII誘導的CFs增殖的作用,這種作用不是血脂康本身的細胞毒性所致,有可能是通過抑制AngII刺激的細胞TGF-β1的表達和/或阻止AngII刺激的細胞進入增殖周期的作用實現(xiàn)的。 第三部分:血脂康對AII誘導新生大鼠心肌成纖維細胞膠原合成及其機制的初步研究 目的:心肌纖維化包括成纖維細胞表型的轉(zhuǎn)變,心肌膠原纖維成分不成比例地增多,排列紊亂,心肌間質(zhì)膠原合成和降解比例失調(diào)

15、等多個方面的改變.有報道表明AngII除促進CFS的增殖外也促進CFS膠原的合成。本研究的第二部分已觀察到血脂康可抑制CFS增殖,但血脂康干預后對I型膠原、III型膠原產(chǎn)生影響,以及其對細胞早期反應基因蛋白c-fos和轉(zhuǎn)化生長因子TGF-β1表達的影響,尚未見報道,本部分觀察了這些指標的變化。 方法:CFs的培養(yǎng)和鑒定同第一部分；細胞培養(yǎng)和實驗分組同第二部分,用天狼星紅法分別測定各實驗組培養(yǎng)上清中膠原蛋白含量.細胞總RNA提取采

16、用Trizol法,RT-PCR法檢測I、III型膠原、C-fos和TGF-β1mRNA的表達,GAPDH用于作內(nèi)參照.擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后紫外透射反射儀觀察擴增產(chǎn)物的大小及亮度并攝影.使用凝膠分析系統(tǒng)對擴增條帶進行密度分析,以GAPDH為內(nèi)參照,以各條帶與GAPDH條帶的密度比值代表相應基因mRNA的相對表達量。 結(jié)果:在細胞經(jīng)處理后48小時后,10-6mol的AngII使CFs膠原蛋白的產(chǎn)生增加,不同濃度的血脂康組膠原蛋

17、白產(chǎn)量均有不同程度的下降,并隨濃度增加下降更明顯,呈劑量依賴性,與AngII組相比,差異有顯著性(P<0.01).表明血脂康對AngII刺激的心肌成纖維細胞膠原產(chǎn)生具有明顯的抑制作用.RT-PCR擴增結(jié)果可見,與對照組相比,Ang II(10-6mol/L)能明顯增加CFs c-fos、TGF-β1、I型膠原和III型膠原mRNA表達,血脂康濃度>30μg/ml時能減弱AngII的這種作用,濃度大于150μg/ml時作用有顯著意義。