Thrombospondin-1在高糖對(duì)心肌成纖維細(xì)胞膠原合成影響中的作用及其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制.pdf

1、研究背景: 研究顯示糖尿病心肌病的主要病理變化包括：心肌細(xì)胞肥大增殖、凋亡，以及心肌間質(zhì)纖維化兩個(gè)方面。以往認(rèn)為心肌病變是以心肌細(xì)胞的肥大增殖為主。然而80年代以后，許多研究結(jié)果表明整個(gè)心臟泵功能的異常不僅僅取決于心肌細(xì)胞的改變，心肌間質(zhì)纖維化在糖尿病心肌病發(fā)病機(jī)制中也起著重要作用。 心肌間質(zhì)纖維化主要包括心臟成纖維細(xì)胞的增生和ECM(Extracellular Matrix)的增生和沉積，心肌組織中膠原含量增高、排列紊

2、亂。在心肌組織中，非心肌細(xì)胞占心臟細(xì)胞總數(shù)的2/3，在維持心臟的結(jié)構(gòu)和功能方面起著不可忽視的作用。在非心肌細(xì)胞中，心肌成纖維細(xì)胞約占90％-95％。心肌成纖維細(xì)胞是合成和分泌細(xì)胞外基質(zhì)的主要細(xì)胞，合成和分泌的細(xì)胞外基質(zhì)包括Ⅰ，Ⅲ和Ⅵ型膠原，彈性纖維和網(wǎng)狀纖維以及蛋白多糖等?，F(xiàn)已證實(shí)，體外模擬糖尿病刺激條件下，成纖維細(xì)胞如腎小球間質(zhì)細(xì)胞合成膠原能力增強(qiáng)，但對(duì)心肌成纖維細(xì)胞合成膠原功能的影響及其機(jī)制知之甚少。 ECM的生成和降解受許

3、多因素的影響和調(diào)控，其中TGFβ作為一個(gè)關(guān)鍵的生長(zhǎng)因子，在轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后及翻譯水平增加膠原等間質(zhì)蛋白質(zhì)的合成，也能抑制細(xì)胞外基質(zhì)的降解，是纖維化形成過(guò)程中的中心環(huán)節(jié)。TGFβ異構(gòu)體中，TGFβ1致組織纖維化作用最強(qiáng)。細(xì)胞外的激活是TGFβ發(fā)揮生物學(xué)活性必不可少的過(guò)程，但是TGFβ的激活途徑尚未完全闡明。TGFβ除可經(jīng)纖溶酶或組織蛋白酶水解產(chǎn)生激活型的TGFβ(A-TGFβ1)外，近年有研究顯示血小板反應(yīng)素(Thrombospondin，T

4、SP)，尤其是TSP-1，是其重要的生理激活物之一。TSP是一種大分子的細(xì)胞外糖蛋白，最初是在被凝血酶刺激的血小板α顆粒釋放的產(chǎn)物中被發(fā)現(xiàn)，以后的研究證實(shí)TSP并非血小板特有，可被腎小球系膜細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等多種細(xì)胞分泌，許多組織如腎臟、心臟、軟骨和腦中都有TSP基因產(chǎn)物的表達(dá)，是許多不同組織細(xì)胞外間質(zhì)的重要成分。由于TSP-1為多結(jié)構(gòu)域分子，故其效應(yīng)多種多樣，最重要的是TSP-1可通過(guò)調(diào)節(jié)其他細(xì)胞因子，而間接引起生物學(xué)行為的改變，尤其

5、TSP-1與L-TGFβ1的LAP區(qū)域結(jié)合，可改變LAP的空間構(gòu)型，使TGFβ1上與受體結(jié)合的位點(diǎn)暴露，成為A-TGFβ1。目前對(duì)TSP-1刺激TGFβ1分泌的研究才剛剛開(kāi)始，主要集中于腎小球纖維化方面的研究，而對(duì)TSP-1/TGFβ1通路在糖尿病心肌病時(shí)心肌間質(zhì)纖維化變化的研究未見(jiàn)報(bào)道。本研究動(dòng)物實(shí)驗(yàn)提示，TSP-1與糖尿病心肌膠原含量增多相關(guān)，盡管目前缺乏充分的證據(jù)，但這個(gè)結(jié)果提示TSP-1可能參與了糖尿病心肌纖維化病理生理過(guò)程。因

6、此，我們提出如下假說(shuō)：糖尿病狀態(tài)(如高糖等刺激)條件下引起心肌成纖維細(xì)胞TSP-1表達(dá)提高，并通過(guò)TSP-1/TGFβ1途徑促進(jìn)心肌成纖維細(xì)胞合成膠原，最后導(dǎo)致心肌纖維化，引起心肌舒張功能障礙。 RNA干擾是是由雙鏈RNA啟動(dòng)的序列特異的轉(zhuǎn)錄后基因沉默過(guò)程，是生物體在進(jìn)化中形成的一種內(nèi)在基因表達(dá)的調(diào)控機(jī)制。與基因敲除技術(shù)相比，RNA干擾操作簡(jiǎn)單、成本低廉，具有高度的序列專(zhuān)一性，可以特異地使特定基因沉默，獲得功能喪失或降低突變，可

7、以作為一種簡(jiǎn)單有效的代替基因敲除的遺傳工具。本實(shí)驗(yàn)采用RNA干擾技術(shù)，通過(guò)轉(zhuǎn)染條件的優(yōu)化，設(shè)計(jì)合成TSP-1小干擾RNA，阻斷心肌成纖維細(xì)胞TSP-1的表達(dá)，從而研究TSP-1在高糖對(duì)心肌成纖維細(xì)胞合成膠原功能的影響中的作用。 目的: 1.探討高糖對(duì)心肌成纖維細(xì)胞TSP-1、TGFβ1的表達(dá)及合成膠原功能的影響； 2.探討利用RNA干擾技術(shù)對(duì)心肌成纖維細(xì)胞進(jìn)行高效、低毒的轉(zhuǎn)染，為研究TSP-1基因功能及信號(hào)通路提

8、供簡(jiǎn)單可行的方法； 3.探討糖/TSP-1/TGFβ1信號(hào)通路在高糖對(duì)心肌成纖維細(xì)胞合成膠原功能的影響中的作用。 方法: 本研究以原代培養(yǎng)的新生大鼠心肌成纖維細(xì)胞為研究對(duì)象。采用實(shí)時(shí)定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(real time RT-PCR)實(shí)驗(yàn)方法，分別觀察： 1.在體外模擬糖尿病狀態(tài)，分為高糖組、低糖組，即分別給予葡萄糖(25mmol/L)、葡萄糖(5.5mmol/L)孵育心肌成纖維細(xì)胞后，檢測(cè)不同時(shí)段

9、TSP-1、TGF β1mRNA以及Ⅰ型和Ⅲ型膠原mRNA的表達(dá)。 2.設(shè)計(jì)、化學(xué)合成TSP-1小干擾RNA，采用陽(yáng)離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染大鼠心肌成纖維細(xì)胞以抑制TSP-1表達(dá)后，觀察上述刺激條件下，大鼠心肌成纖維細(xì)胞TGFβ1mRNA以及Ⅰ型和Ⅲ型膠原mRNA表達(dá)的變化。 結(jié)果: 1.不同濃度葡萄糖刺激下，心肌成纖維細(xì)胞TSP-1/TGFβ1/I型、IIl型膠原mRNA的表達(dá)水平(1)高糖對(duì)心肌成纖維細(xì)胞Ⅰ型和Ⅲ型膠原

10、mRNA表達(dá)的影響： 分別以高糖(25 mmol/L)、低糖(5.5mmol/L)條件孵育心肌成纖維細(xì)胞0h、4h、8h、12h、24h、48h、72h。在8h內(nèi)，高糖時(shí)間依賴(lài)性刺激心肌成纖維細(xì)胞Ⅰ型和Ⅲ型膠原mRNA合成，8h達(dá)到峰值，分別為低糖對(duì)照組的7.52倍和7.57倍(P<0.01)，其后逐漸降低，但仍高于對(duì)照組。至24-48h之后逐漸趨于穩(wěn)定。 (2)高糖對(duì)心肌成纖維細(xì)胞TSP-1mRNA表達(dá)的影響：

11、 在8h內(nèi)，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，高糖引起心肌成纖維細(xì)胞TSP-1mRNA表達(dá)水平逐漸增高，至8h提高7.73倍(P<0.01)；培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)至8h-24h，高糖引起心肌成纖維細(xì)胞TSP-1mRNA表達(dá)水平呈逐漸下降趨勢(shì)，但仍高于低糖對(duì)照組(P<0.01)。 (3)高糖對(duì)心肌成纖維細(xì)胞TGFβ1mRNA表達(dá)的影響： 在48h內(nèi)，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，高糖引起心肌成纖維細(xì)胞TGFβ1mRNA表達(dá)水平逐漸增高，至48h提高127

12、.1倍(P<0.01)；培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)至72h，高糖引起心肌成纖維細(xì)胞TGFβ1mRNA表達(dá)水平呈逐漸下降趨勢(shì)，但仍高于低糖對(duì)照組。 2.特異性TSP-1siRNA轉(zhuǎn)染心肌成纖維細(xì)胞后TSP-TGFβ1/Ⅰ型、Ⅲ型膠原mRNA的表達(dá)水平(1)四對(duì)TSP-1特異siRNA中，第四對(duì)siRNA下調(diào)TSP-1mRNA的表達(dá)水平效率為81％高，轉(zhuǎn)染效果最顯著(P<0.01)。抑制效率和濃度不成線性關(guān)系，最佳抑制濃度為40ummol/L。T

13、SP-1特異性siRNA序列為：sence 5'-GGAAAGAUUUCACUGCAUATT-3'anti-sence 5'-UAUGCAGUGAAAUCUUUCCAG-3' (2)與空白組相比，單純脂質(zhì)體組TSP-1、TGFβ1mRNA的表達(dá)略有降低，但其差異未達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，陰性對(duì)照組TSP-1、TGFβ1、I和III型膠原mRNA表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與空白組相比，陰性對(duì)照+高糖組和高糖

14、組TSP-1、TGFβ1、I和III型膠原mRNA的表達(dá)水平均顯著升高(P<0.05)，但陰性對(duì)照+高糖組和高糖組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。 (3)與空白組相比，單純siRNA組除TSP-1明顯抑制外，TGFβ1、I型和III型膠原mRNA表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。 (4)與空白組相比，高糖刺激心肌成纖維細(xì)胞8h后，其TSP-1、TGFβ1、I和III型膠原mRNA的表達(dá)水平均明顯升高(P<0

15、.05～0.001)；但篩選最佳抑制效果TSP-1siRNA抑制TSP-1表達(dá)后，與高糖組相比，siRNA+高糖組TGFβ1、I型膠原mRNA的表達(dá)水平均明顯減低(P<0.05)，III型膠原mRNA的表達(dá)水平呈減低趨勢(shì)，差異未達(dá)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，但與空白組和單純siRNA組相比，siRNA+高糖組TGFβ1、I和III型膠原mRNA的表達(dá)水平有略增高趨勢(shì)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。 結(jié)論: 1.高糖