基于抗原表位分析的妊娠相關(guān)血漿蛋白A的克隆表達及其臨床診斷應用研究.pdf

1、目的：
　　針對妊娠相關(guān)血漿蛋白A(PAPP-A)CDS區(qū)的特定抗原表位，利用重組克隆技術(shù)，制備PAPP-A重組蛋白，利用這種抗原蛋白免疫家兔，制備多克隆抗體，在此基礎(chǔ)上制備酶標記抗體以及生物素化抗體。建立一種針對PAPP-A的高靈敏度酶聯(lián)免疫檢測(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)方法，制備相關(guān)的試劑盒，在臨床上應用于產(chǎn)前篩查唐氏綜合征(Down syndrome，DS)和急性冠狀動

2、脈綜合征(acute coronary syndrome，ACS)，指導相關(guān)疾病的診治。
　　方法：
　　1.借助于DNAstar軟件，分析PAPP-A的CDS區(qū)，選擇抗原性最強的一段抗原表位編碼區(qū)。
　　2.從新鮮胎盤組織中提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄并PCR生成PAPP-A編碼區(qū)的DNA；另一方法是購買PAPP-A-質(zhì)粒轉(zhuǎn)化菌種制備DNA。
　　3.PAPP-A的DNA和pET42a質(zhì)粒分別雙酶切，凝膠回收之后連接，

3、轉(zhuǎn)化TOp10大腸桿菌，篩選陽性克隆鑒定正確后，轉(zhuǎn)化BL21大腸桿菌，誘導產(chǎn)生PAPP-A重組蛋白。利用鎳柱純化。
　　4.制備的重組蛋白注射家兔，制備抗PAPP-A抗體。并用金黃色葡萄球菌蛋白A(SPA)親和層析法純化PAPP-A抗體。
　　5.抗原的純化。足月孕婦血清依次用免疫親和層析法，離子交換法以及分子篩法純化。
　　6.用辣根過氧化物酶(HRP)和生物素(Biotin)標記PAPP-A抗體并且優(yōu)化反應條件。<

4、br>　　7.將以上的方法進行靈敏性、重復性、穩(wěn)定性等的方法學評價。
　　8.用靈敏以及超敏感試劑盒檢測相關(guān)DS、ACS標本。
　　結(jié)果：
　　1.利用DNAstat軟件，結(jié)合對PAPP-A序列信號肽位置的預測，疏水性、二級結(jié)構(gòu)，結(jié)果表明堿基序列1-309 bp帶有信號肽，這一區(qū)段表達的重組蛋白能夠自由進出細胞膜，易于分泌到血液中。
　　2.本研究購進轉(zhuǎn)化入細菌的PAPP-A基因質(zhì)粒，結(jié)果成功從擴大培養(yǎng)的細菌中得

5、到DNA。
　　3.按照常規(guī)的制備重組蛋白的方法，成功制備PAPP-A重組蛋白。
　　4.利用制備的PAPP-A重組蛋白注射新西蘭家兔2只，得到PAPP-A抗體，利用瓊脂雙向凝膠擴散測定效價，達到1:16。
　　5.將抗體連接在凝膠上，裝在柱子中，制成免疫層析柱。
　　6.酶標抗體的制備采用過碘酸鈉法。得到的即為標記酶。測定酶的量：1.2mg/mL，生物素化也成功制備。
　　7.足月孕婦血清經(jīng)過親和層析，離

6、子交換以及分子篩層析之后，在SDS-PAGE檢測的條帶中呈現(xiàn)較為單一的條帶，效果良好。
　　8.檢測不同孕期孕婦是否有DS。BA-ELIsA方法的建立在檢測第一二孕期是否有DS患兒有較大的臨床價值。我們制備了高靈敏的檢測ACS患者的BA-ELISA試劑盒同樣發(fā)現(xiàn)有較大臨床應用價值。
　　結(jié)論：
　　本研究有針對性的制備PAPP-A重組蛋白，可以避免了其他抗原表位的干擾，使得抗原蛋白特異性增強，并且重組蛋白能夠較為容易得