內(nèi)皮素1在星形膠質(zhì)細(xì)胞過表達(dá)對小鼠脊髓損傷后運(yùn)動功能恢復(fù)的影響.pdf

1、中樞神經(jīng)系統(tǒng)的損傷主要是指腦損傷和脊髓的損傷。脊髓損傷可以分為原發(fā)性的脊髓損傷(primary spinal cord injury)和繼發(fā)性的脊髓損傷(secondary spinal cord injury,SSCI),繼發(fā)性脊髓損傷伴隨在原發(fā)性損傷之后。原發(fā)性損傷主要指的是脊髓組織由于受到機(jī)械力的作用造成的機(jī)械性損傷,如擠壓,撕裂等,繼發(fā)性損傷是在脊髓原發(fā)性損傷以后,由于血脊髓屏障破壞、血管損傷、損傷附近的組織細(xì)胞缺氧、組織壞死等

2、造成炎癥細(xì)胞的浸入或者損傷周圍組織細(xì)胞微環(huán)境分子平衡遭到破壞而引起的更大面積的脊髓損傷。相對于脊髓原發(fā)性損傷的不可控因素,防止繼發(fā)性損傷一直的科學(xué)研究的主要目標(biāo),但是繼發(fā)性脊髓損傷的出現(xiàn)是一個相當(dāng)復(fù)雜的過程,它包括多種因素的綜合作用。脊髓損傷后眾多對脊髓組織有傷害作用的細(xì)胞和分子都是來自循環(huán)系統(tǒng),而這些細(xì)胞和分子在正常的生理條件下由于血脊髓屏障的存在是無法進(jìn)入到脊髓組織當(dāng)中,當(dāng)脊髓損傷后由于血脊髓屏障受到破壞,所以這些平時無法進(jìn)入到脊髓

3、組織的細(xì)胞和分子就會進(jìn)入到脊髓當(dāng)中,因此原發(fā)性脊髓損傷后防止進(jìn)一步的血脊髓屏障遭到破壞或者及時修復(fù)破壞的血脊髓屏障是防止脊髓繼發(fā)性損傷的重要策略。
　　內(nèi)皮素是一類血管收縮物質(zhì),是一類多肽分子家族,主要有三種亞型:內(nèi)皮素1(ET-1)、內(nèi)皮素2(ET-1)、內(nèi)皮素3(ET-3)和兩種受體A(ETA)和受體B(ETB)。內(nèi)皮素是目前發(fā)現(xiàn)的最強(qiáng)烈的血管收縮物質(zhì),其ETA主要分布在血管平滑細(xì)胞,受ETB在體內(nèi)很多組織細(xì)胞都有分布,在中樞

4、神經(jīng)系統(tǒng)的組織細(xì)胞中也有內(nèi)皮素ETB的發(fā)現(xiàn),尤其在星形膠質(zhì)細(xì)胞,對于其ETB的作用的研究也越來越多。
　　由于血脊髓屏障的主要結(jié)構(gòu)是由血管內(nèi)皮細(xì)胞、周細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞構(gòu)成,而血管內(nèi)皮細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞都有內(nèi)皮素受體的分布,因此本實(shí)驗(yàn)主要研究了ET-1在星形膠質(zhì)細(xì)胞過表達(dá)后對小鼠脊髓損傷后運(yùn)動功能恢復(fù)的影響以及其主要可能的機(jī)制。
　　實(shí)驗(yàn)一: GET-1純合子小鼠的篩選和野生型小鼠脊髓損傷后運(yùn)動功能恢復(fù)的差異
　　本部

5、分實(shí)驗(yàn)首先篩選出GET-1純合子小鼠。由于本實(shí)驗(yàn)用的GET-1轉(zhuǎn)基因小鼠無法確定外源基因片段在染色體上的定位,因此要想獲得GET-1純合子小鼠,只有通過交配策略,來獲得GET-1純合子小鼠。所以我們首先將PCR檢測為陽性的兩只半合子GET-1小鼠交配,然后將其后代中PCR鑒定為陽性的后代同胞之間進(jìn)行交配,再將這一代PCR鑒定為陽性的GET-1轉(zhuǎn)基因小鼠與野生型小鼠交配產(chǎn)生后代,如果后代全部為GET-1PCR鑒定為陽性小鼠則可確定其父/母

6、代GET-1小鼠為GET-1純合子小鼠。篩選出純合子GE T-1轉(zhuǎn)基因小鼠后與野生型小鼠一起建立脊髓夾傷模型,通過BMS小鼠運(yùn)動功能學(xué)評分顯示:GET-1小鼠在脊髓損傷后其運(yùn)動功能恢復(fù)不如野生型小鼠運(yùn)動恢復(fù)的好。然后我們觀察統(tǒng)計了兩種小鼠在脊髓損傷后的7d和14d損傷面積的大小,結(jié)果顯示GET-1轉(zhuǎn)基因小鼠的損傷面積大于WT小鼠的損傷面積。本部分實(shí)驗(yàn)表明內(nèi)皮素1(ET-1)在星形膠質(zhì)細(xì)胞過表達(dá)后可能作用與某些機(jī)制,抑制了小鼠脊髓損傷后神

7、經(jīng)元的再生或者在脊髓損傷后造成了更加嚴(yán)重的脊髓組織的破壞。
　　實(shí)驗(yàn)二:內(nèi)皮素1在星形膠質(zhì)細(xì)胞過表達(dá)后對小鼠脊髓損傷后血脊髓屏障的影響
　　本部分實(shí)驗(yàn)我們主要研究的是內(nèi)皮素1(ET-1)在星形膠質(zhì)細(xì)胞過表達(dá)后是造成怎樣的損傷機(jī)制來影響小鼠脊髓損傷后運(yùn)動功能的恢復(fù)。首先我們檢測了內(nèi)皮素1(ET-1)在脊髓損傷后1d、3d、7d、14d在GET-1轉(zhuǎn)基因小鼠和野生型小鼠的表達(dá)情況,結(jié)果顯示在脊髓損傷后3d時野生型小鼠內(nèi)皮素1的表

8、達(dá)首先下降,然后上升,但是仍然低于沒有脊髓損傷的正常生理條件的表達(dá),而GET-1轉(zhuǎn)基因小鼠在脊髓隨損傷后內(nèi)皮素1(ET-1)的表達(dá)有了一定程度的下調(diào),這可能是由于脊髓損傷后血管結(jié)構(gòu)的破壞造成的。隨后我們進(jìn)行血脊髓屏障破壞程度的檢測。通常情況下小鼠脊髓損傷后血脊髓屏障的破壞主要出現(xiàn)在損傷后的24h之內(nèi),我們在GET-1轉(zhuǎn)基因小鼠和野生型小鼠脊髓損傷24h后通過小鼠尾靜脈灌注Eva ns b lue,30 min后取冰凍切片直接觀察到GET

9、-1轉(zhuǎn)基因小鼠在脊髓損傷24h時,Eva ns blue在脊髓損傷部位的滲出量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于野生小鼠的滲出量,通過用酶標(biāo)儀測定脊髓損傷中心兩端0.5c m組織中Evans blue的滲出量,統(tǒng)計結(jié)果印證了前面觀察到的結(jié)果。本部分實(shí)驗(yàn)證明內(nèi)皮素1(ET-1)在星形膠質(zhì)細(xì)胞過表達(dá)后嚴(yán)重影響了小鼠脊髓損傷后血脊髓屏障的完整性,進(jìn)而可能造成了兩種小鼠脊髓損傷后運(yùn)動學(xué)功能恢復(fù)的差異
　　實(shí)驗(yàn)三:內(nèi)皮素1在星形膠質(zhì)過表達(dá)對小鼠脊髓損傷后損傷中心附近