亞低溫對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞缺氧-復(fù)氧后CyclinD1表達(dá)的影響.pdf

1、目的: 觀察缺氧/復(fù)氧損傷后體外培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞細(xì)胞周期蛋白D1（CyclinD1）表達(dá)的變化，及亞低溫干預(yù)對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞CyclinD1表達(dá)的影響，探討亞低溫對(duì)腦缺血再灌注損傷的可能保護(hù)機(jī)制。
　　 方法: 利用新生24小時(shí)內(nèi)的SD大鼠，取皮層新鮮腦組織，參照McCarthy等的方法加以改進(jìn)進(jìn)行星形膠質(zhì)細(xì)胞（astrocyte,AC）原代培養(yǎng)，調(diào)整細(xì)胞密度為5×105/cm2，接種到含胎牛血清培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱

2、內(nèi)。利用倒置顯微鏡觀察AC生長(zhǎng)及分化的形態(tài)學(xué)變化。7-8天后傳代，傳至第3代，細(xì)胞自然純化后，采用神經(jīng)膠質(zhì)纖維酸性蛋白（glia fibrillary acid protein，GFAP）免疫細(xì)胞化學(xué)染色法鑒定AC，95％以上為陽(yáng)性細(xì)胞，符合實(shí)驗(yàn)要求。將AC分為正常對(duì)照組?、常溫缺氧/復(fù)氧組(H/R)、亞低溫干預(yù)缺氧/復(fù)氧組(M+H/R)。用三氣培養(yǎng)箱分別調(diào)節(jié)溫度37℃及32℃，以95％N2和5％CO2造成細(xì)胞缺氧，50min后始記缺氧

3、損傷時(shí)間，缺氧完畢后回復(fù)正常條件培養(yǎng)開始記時(shí)復(fù)氧時(shí)間。每組設(shè)缺氧8小時(shí)，復(fù)氧4小時(shí),8小時(shí),12小時(shí),16小時(shí),20小時(shí)6個(gè)時(shí)間點(diǎn)，建立AC缺氧/復(fù)氧模型。用倒置相差顯微鏡觀察各個(gè)時(shí)間點(diǎn)AC的形態(tài)學(xué)變化，臺(tái)盼藍(lán)染色法測(cè)定AC的存活率，作為細(xì)胞損傷指標(biāo)，細(xì)胞免疫熒光技術(shù)觀察CyclinD1表達(dá)的變化，Western-blot法半定量分析CyclinD1表達(dá)的變化。
　　 結(jié)果:
　　 1.體外培養(yǎng)AC及GFAP鑒定結(jié)果：

4、AC傳3代后，細(xì)胞呈星形，胞體較大而扁，突起較多而長(zhǎng)，呈放射狀。GFAP免疫細(xì)胞化學(xué)染色鑒定AC，95％為陽(yáng)性。胞體呈三角形，胞漿呈棕黃色，深褐色為強(qiáng)陽(yáng)性，突起細(xì)，胞膜光滑，邊界清楚。
　　 2.倒置顯微鏡觀察及臺(tái)盤藍(lán)染色結(jié)果：AC在缺氧復(fù)氧條件下隨干預(yù)時(shí)間延長(zhǎng)而呈現(xiàn)不同的形態(tài)學(xué)變化，缺氧8小時(shí)后，37℃及32℃組AC的形態(tài)，存活力變化不明顯，僅部分細(xì)胞邊緣皺縮。隨復(fù)氧時(shí)間的延長(zhǎng)，37℃組AC損傷逐漸明顯，有的細(xì)胞輪廓模糊，細(xì)胞

5、腫脹、胞漿有空泡形成。突起增粗縮短，細(xì)胞間連接斷裂，逐漸出現(xiàn)細(xì)胞死亡、崩解、胞體懸浮,呈不同程度的纖維樣變，細(xì)胞存活力下降明顯，32℃組可見少數(shù)細(xì)胞胞體肥大，胞內(nèi)顆粒變性，細(xì)胞分離。大部分AC輪廓較清晰，胞周光暈明顯，突起尚存。細(xì)胞損傷出現(xiàn)的時(shí)間要比常溫組晚，細(xì)胞存活力較37℃組增高。
　　 3.細(xì)胞免疫熒光化學(xué)染色：AC呈多邊形，胞體大，突起可見，胞核呈橢圓形，位于細(xì)胞中央，CyclinD1陽(yáng)性產(chǎn)物為綠色，37℃正常氧供時(shí)Cy

6、clinD1的表達(dá)無(wú)明顯變化；缺氧8小時(shí)后,CyclinD1免疫反應(yīng)強(qiáng)度增加；復(fù)氧后，隨時(shí)間延長(zhǎng)呈明顯增高趨勢(shì), 32℃組各時(shí)間點(diǎn)CyclinD1的免疫表達(dá)均較37℃組減少。
　　 4.Westernblot法檢測(cè)：37℃正常氧供時(shí)CyclinD1的表達(dá)無(wú)明顯變化；缺氧8小時(shí)后CyclinD1的表達(dá)量增多；隨復(fù)氧時(shí)間延長(zhǎng)呈增高趨勢(shì)，與對(duì)照組相比差異有顯著性(p<0.01)，32℃組CyclinD1的表達(dá)量在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)與對(duì)照組相比