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文檔簡(jiǎn)介
1、目的: 觀察缺氧/復(fù)氧損傷后體外培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞細(xì)胞周期蛋白D1(CyclinD1)表達(dá)的變化,及亞低溫干預(yù)對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞CyclinD1表達(dá)的影響,探討亞低溫對(duì)腦缺血再灌注損傷的可能保護(hù)機(jī)制。
方法: 利用新生24小時(shí)內(nèi)的SD大鼠,取皮層新鮮腦組織,參照McCarthy等的方法加以改進(jìn)進(jìn)行星形膠質(zhì)細(xì)胞(astrocyte,AC)原代培養(yǎng),調(diào)整細(xì)胞密度為5×105/cm2,接種到含胎牛血清培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中,置于細(xì)胞培養(yǎng)箱
2、內(nèi)。利用倒置顯微鏡觀察AC生長(zhǎng)及分化的形態(tài)學(xué)變化。7-8天后傳代,傳至第3代,細(xì)胞自然純化后,采用神經(jīng)膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glia fibrillary acid protein,GFAP)免疫細(xì)胞化學(xué)染色法鑒定AC,95%以上為陽(yáng)性細(xì)胞,符合實(shí)驗(yàn)要求。將AC分為正常對(duì)照組?、常溫缺氧/復(fù)氧組(H/R)、亞低溫干預(yù)缺氧/復(fù)氧組(M+H/R)。用三氣培養(yǎng)箱分別調(diào)節(jié)溫度37℃及32℃,以95%N2和5%CO2造成細(xì)胞缺氧,50min后始記缺氧
3、損傷時(shí)間,缺氧完畢后回復(fù)正常條件培養(yǎng)開始記時(shí)復(fù)氧時(shí)間。每組設(shè)缺氧8小時(shí),復(fù)氧4小時(shí),8小時(shí),12小時(shí),16小時(shí),20小時(shí)6個(gè)時(shí)間點(diǎn),建立AC缺氧/復(fù)氧模型。用倒置相差顯微鏡觀察各個(gè)時(shí)間點(diǎn)AC的形態(tài)學(xué)變化,臺(tái)盼藍(lán)染色法測(cè)定AC的存活率,作為細(xì)胞損傷指標(biāo),細(xì)胞免疫熒光技術(shù)觀察CyclinD1表達(dá)的變化,Western-blot法半定量分析CyclinD1表達(dá)的變化。
結(jié)果:
1.體外培養(yǎng)AC及GFAP鑒定結(jié)果:
4、AC傳3代后,細(xì)胞呈星形,胞體較大而扁,突起較多而長(zhǎng),呈放射狀。GFAP免疫細(xì)胞化學(xué)染色鑒定AC,95%為陽(yáng)性。胞體呈三角形,胞漿呈棕黃色,深褐色為強(qiáng)陽(yáng)性,突起細(xì),胞膜光滑,邊界清楚。
2.倒置顯微鏡觀察及臺(tái)盤藍(lán)染色結(jié)果:AC在缺氧復(fù)氧條件下隨干預(yù)時(shí)間延長(zhǎng)而呈現(xiàn)不同的形態(tài)學(xué)變化,缺氧8小時(shí)后,37℃及32℃組AC的形態(tài),存活力變化不明顯,僅部分細(xì)胞邊緣皺縮。隨復(fù)氧時(shí)間的延長(zhǎng),37℃組AC損傷逐漸明顯,有的細(xì)胞輪廓模糊,細(xì)胞
5、腫脹、胞漿有空泡形成。突起增粗縮短,細(xì)胞間連接斷裂,逐漸出現(xiàn)細(xì)胞死亡、崩解、胞體懸浮,呈不同程度的纖維樣變,細(xì)胞存活力下降明顯,32℃組可見少數(shù)細(xì)胞胞體肥大,胞內(nèi)顆粒變性,細(xì)胞分離。大部分AC輪廓較清晰,胞周光暈明顯,突起尚存。細(xì)胞損傷出現(xiàn)的時(shí)間要比常溫組晚,細(xì)胞存活力較37℃組增高。
3.細(xì)胞免疫熒光化學(xué)染色:AC呈多邊形,胞體大,突起可見,胞核呈橢圓形,位于細(xì)胞中央,CyclinD1陽(yáng)性產(chǎn)物為綠色,37℃正常氧供時(shí)Cy
6、clinD1的表達(dá)無(wú)明顯變化;缺氧8小時(shí)后,CyclinD1免疫反應(yīng)強(qiáng)度增加;復(fù)氧后,隨時(shí)間延長(zhǎng)呈明顯增高趨勢(shì), 32℃組各時(shí)間點(diǎn)CyclinD1的免疫表達(dá)均較37℃組減少。
4.Westernblot法檢測(cè):37℃正常氧供時(shí)CyclinD1的表達(dá)無(wú)明顯變化;缺氧8小時(shí)后CyclinD1的表達(dá)量增多;隨復(fù)氧時(shí)間延長(zhǎng)呈增高趨勢(shì),與對(duì)照組相比差異有顯著性(p<0.01),32℃組CyclinD1的表達(dá)量在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)與對(duì)照組相比
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