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文檔簡介
1、脊髓損傷所致的神經(jīng)功能障礙是全球性的醫(yī)療難題,損傷部位膠質(zhì)瘢痕及抑制性微環(huán)境的產(chǎn)生是導(dǎo)致治療困難的關(guān)鍵原因之一。14-3-3蛋白在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中含量極為豐富,被多項研究證實對腦神經(jīng)元缺血缺氧損傷有保護(hù)作用。但其在脊髓組織中的研究和應(yīng)用相對較少,脊髓損傷方面更是寥寥無幾。有報道發(fā)現(xiàn)脊髓損傷早期14-3-3ε蛋白明顯增高,而其在神經(jīng)元缺血缺氧損傷后的活性并無明顯變化。因而我們推測,脊髓損傷后早期14-3-3ε蛋白在脊髓中的高表達(dá)可能與星形膠
2、質(zhì)細(xì)胞的活化有關(guān),14-3-3ε蛋白可能影響或參與星形膠質(zhì)細(xì)胞在損傷早期的活化。通過體外原代培養(yǎng)星形膠質(zhì)細(xì)胞以及大鼠脊髓損傷兩部分實驗,初步探查14-3-3ε蛋白在脊髓損傷活化星形膠質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá)變化,試圖為脊髓損傷后抑制膠質(zhì)瘢痕形成、促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)提供一個新的可供選擇的思路和方向。
第一部分 14-3-3ε蛋白在損傷后原代培養(yǎng)活化星形膠質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá)
目的:初探損傷后星形膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)14-3-3ε蛋白和GFAP
3、水平的變化趨勢和相關(guān)關(guān)系
方法:原代培養(yǎng)新生SD大鼠大腦皮層星形膠質(zhì)細(xì)胞,建立體外缺糖缺氧/缺血-再灌注模型和機(jī)械劃傷模型,通過免疫蛋白印跡和免疫熒光雙標(biāo)染色的方法,檢測損傷后活化的星形膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)活化標(biāo)志物膠質(zhì)纖維酸性蛋白(Glial fibrillaryacidic protein,GFAP)和目的蛋白14-3-3ε隨時間變化(4h、8h、12/16h、24h、48h、72h)的趨勢和相關(guān)關(guān)系。
結(jié)果一(體外缺糖
4、缺氧/缺血-再灌注模型結(jié)果):①.造模后目的蛋白14-3-3和星形膠質(zhì)細(xì)胞活化標(biāo)志物GFAP表達(dá)水平變化趨勢的關(guān)系:損傷早期(缺糖缺氧4h),14-3-3蛋白和GFAP表達(dá)水平便開始明顯增多,且持續(xù)高水平表達(dá)至損傷后期。兩者不同的是,14-3-3ε的高峰時間先于GFAP出現(xiàn),具體表現(xiàn)為:造模后GFAP的表達(dá)呈持續(xù)性增多的趨勢,而14-3-3ε在造模后24h達(dá)到最高峰值,后期(48h)甚至稍有下降;②.造模后14-3-3ε和GFAP表達(dá)水
5、平間的數(shù)量依存關(guān)系:在表達(dá)水平呈現(xiàn)上升趨勢的造模后εε小時內(nèi),14-3-3和GFAP的表達(dá)水平間存在具有統(tǒng)計學(xué)意義的線性相關(guān)關(guān)系(R2=0.3060,P=0.017);造模后48h,由于14-3-3ε和GFAP變化趨勢不同(14-3-3開始出現(xiàn)下降趨勢,GFAP仍然呈持續(xù)性上升趨勢),從而造成線性相關(guān)關(guān)系無統(tǒng)計學(xué)差異(R2=0.0996,P=0.133);造模后14-3-3和GFAP的表達(dá)定位關(guān)系:免疫熒光染色顯示14-3-3ε和GFA
6、P的表達(dá)有高度一致的亞細(xì)胞定位(胞質(zhì)),且在表達(dá)強(qiáng)度上兩者也具有高度的一致性:即14-3-3ε表達(dá)強(qiáng)的細(xì)胞內(nèi)也有高表達(dá)強(qiáng)度的GFAP。ε
結(jié)果二(體外機(jī)械劃傷模型結(jié)果):①.造模后14-3-3ε和GFAP表達(dá)水平變化趨勢的關(guān)系:與缺糖缺氧/缺血-再灌注模型模型不同,機(jī)械劃傷模型中的14-3-3ε蛋白變化趨勢不明顯,各時間點之間蛋白水平變化無統(tǒng)計學(xué)差異;但GFAP的升高趨勢較為明顯,尤其是在48h可檢測到GFAP的顯著性增多。②
7、.造模后14-3-3ε和GFAP表達(dá)水平間的數(shù)量依存關(guān)系:線性相關(guān)分析結(jié)果顯示14-3-3和GFAP的表達(dá)水平存在顯著線性相關(guān)關(guān)系(R2=0.3119,P=0.009),線性回歸系數(shù)為0.3646,證實了GFAP與14-3-3表達(dá)水平之間存在數(shù)量依存關(guān)系;造模后14-3-3ε和GFAP的表達(dá)定位關(guān)系:免疫熒光染色同樣顯示14-3-3ε蛋白和GFAP在活化星形膠質(zhì)細(xì)胞中良好的共定位,具體表現(xiàn)包括造模后14-3-3ε和GFAP均表達(dá)增強(qiáng)(較
8、對照組)強(qiáng)度且同一時間點時,越靠近劃痕14-3-3和GFAP表達(dá)強(qiáng)度越高。
結(jié)論:目的蛋白14-3-3和星形膠質(zhì)細(xì)胞活化標(biāo)志物GFAP在損傷早期活化的星形膠質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá)增多,二者不僅表達(dá)變化趨勢相似,表達(dá)水平間也存在顯著的線性相關(guān)關(guān)系,并且在細(xì)胞中具有高度一致的亞細(xì)胞定位。因此,可以認(rèn)為損傷早期星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)源性表達(dá)14-3-3ε蛋白與星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化有關(guān),14-3-3ε蛋白可能通過星形膠質(zhì)細(xì)胞活化從而在脊髓損傷中發(fā)揮相應(yīng)
9、的作用。
第二部分 14-3-3蛋白在SD大鼠脊髓損傷中的表達(dá)
目的:了解14-3-3蛋白和GFAP在脊髓損傷后的表達(dá)趨勢及相關(guān)關(guān)系
方法:利用Allen's模型造成成年SD大鼠T10節(jié)段的脊髓損傷,在損傷后4h、8h、16h、24h、3d、7d、14d和28d分別快速冰上取材或灌流取材,獲得以損傷處為中心的脊髓組織。通過免疫蛋白印跡和免疫熒光染色的方法,檢測活化AS標(biāo)志物GFAP和目的蛋白14-3-3的表
10、達(dá)變化,探究二者的相關(guān)性。
結(jié)果:①.脊髓損傷后14-3-3和GFAP表達(dá)水平變化趨勢的關(guān)系:與體外缺糖缺氧/缺血-再灌注造模類似,GFAP和14-3-3蛋白的表達(dá)在脊髓損傷早期(4h或8h)便開始明顯增多。14-3-3蛋白在SCI后最初的24小時呈現(xiàn)出較為顯著的上升趨勢,傷后7到28天的表達(dá)相對穩(wěn)定;而GFAP的表達(dá)隨著損傷時間的延長逐漸增加,且一直持續(xù)高表達(dá)至28d;兩者相比,14-3-3的上升平臺期先于GFAP出現(xiàn)。②.
11、脊髓損傷后14-3-3和GFAP表達(dá)水平間的數(shù)量依存關(guān)系:線性相關(guān)分析顯示14-3-3ε蛋白與GFAP的表達(dá)水平之間存在數(shù)量依存關(guān)系(線性回歸系數(shù)=0.6478,R2=0.7100,P<0.001),證實了體內(nèi)實驗時GFAP與14-3-3表達(dá)水平之間也存在數(shù)量依存關(guān)系;脊髓損傷后14-3-3和GFAP的表達(dá)定位關(guān)系:免疫熒光染色結(jié)果顯示了14-3-3ε和GFAP在脊髓損傷后的脊髓組織中具有的良好的定位共性,包括造模組兩者的表達(dá)強(qiáng)度明顯高
12、于假手術(shù)組的表達(dá)強(qiáng)度、14-3-3表達(dá)強(qiáng)的組織部位也有高表達(dá)強(qiáng)度的GFAP等。
結(jié)論:SCI后14-3-3蛋白和GFAP表達(dá)在損傷周圍的脊髓組織中明顯增加,盡管14-3-3ε蛋白的變化先于GFAP達(dá)到平臺期,但二者在表達(dá)水平仍然存在顯著的線性相關(guān)關(guān)系、共同的變化趨勢以及一致的組織定位。在體實驗進(jìn)一步證實了脊髓損傷后早期14-3-3ε蛋白在脊髓中的高表達(dá)可能與星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化有關(guān),其可能影響或參與星形膠質(zhì)細(xì)胞在損傷早期的活化。
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