14-3-3ε蛋白在脊髓損傷星形膠質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá)研究.pdf

1、脊髓損傷所致的神經(jīng)功能障礙是全球性的醫(yī)療難題，損傷部位膠質(zhì)瘢痕及抑制性微環(huán)境的產(chǎn)生是導(dǎo)致治療困難的關(guān)鍵原因之一。14-3-3蛋白在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中含量極為豐富，被多項研究證實對腦神經(jīng)元缺血缺氧損傷有保護(hù)作用。但其在脊髓組織中的研究和應(yīng)用相對較少，脊髓損傷方面更是寥寥無幾。有報道發(fā)現(xiàn)脊髓損傷早期14-3-3ε蛋白明顯增高，而其在神經(jīng)元缺血缺氧損傷后的活性并無明顯變化。因而我們推測，脊髓損傷后早期14-3-3ε蛋白在脊髓中的高表達(dá)可能與星形膠

2、質(zhì)細(xì)胞的活化有關(guān)，14-3-3ε蛋白可能影響或參與星形膠質(zhì)細(xì)胞在損傷早期的活化。通過體外原代培養(yǎng)星形膠質(zhì)細(xì)胞以及大鼠脊髓損傷兩部分實驗，初步探查14-3-3ε蛋白在脊髓損傷活化星形膠質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá)變化，試圖為脊髓損傷后抑制膠質(zhì)瘢痕形成、促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)提供一個新的可供選擇的思路和方向。
　　第一部分 14-3-3ε蛋白在損傷后原代培養(yǎng)活化星形膠質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá)
　　目的：初探損傷后星形膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)14-3-3ε蛋白和GFAP

3、水平的變化趨勢和相關(guān)關(guān)系
　　方法：原代培養(yǎng)新生SD大鼠大腦皮層星形膠質(zhì)細(xì)胞，建立體外缺糖缺氧/缺血-再灌注模型和機(jī)械劃傷模型，通過免疫蛋白印跡和免疫熒光雙標(biāo)染色的方法，檢測損傷后活化的星形膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)活化標(biāo)志物膠質(zhì)纖維酸性蛋白（Glial fibrillaryacidic protein,GFAP）和目的蛋白14-3-3ε隨時間變化（4h、8h、12/16h、24h、48h、72h）的趨勢和相關(guān)關(guān)系。
　　結(jié)果一（體外缺糖

4、缺氧/缺血-再灌注模型結(jié)果）：①.造模后目的蛋白14-3-3和星形膠質(zhì)細(xì)胞活化標(biāo)志物GFAP表達(dá)水平變化趨勢的關(guān)系：損傷早期（缺糖缺氧4h），14-3-3蛋白和GFAP表達(dá)水平便開始明顯增多，且持續(xù)高水平表達(dá)至損傷后期。兩者不同的是，14-3-3ε的高峰時間先于GFAP出現(xiàn)，具體表現(xiàn)為：造模后GFAP的表達(dá)呈持續(xù)性增多的趨勢，而14-3-3ε在造模后24h達(dá)到最高峰值，后期（48h）甚至稍有下降；②.造模后14-3-3ε和GFAP表達(dá)水

5、平間的數(shù)量依存關(guān)系：在表達(dá)水平呈現(xiàn)上升趨勢的造模后εε小時內(nèi)，14-3-3和GFAP的表達(dá)水平間存在具有統(tǒng)計學(xué)意義的線性相關(guān)關(guān)系（R2=0.3060，P=0.017）；造模后48h，由于14-3-3ε和GFAP變化趨勢不同（14-3-3開始出現(xiàn)下降趨勢，GFAP仍然呈持續(xù)性上升趨勢），從而造成線性相關(guān)關(guān)系無統(tǒng)計學(xué)差異（R2=0.0996，P=0.133）；造模后14-3-3和GFAP的表達(dá)定位關(guān)系：免疫熒光染色顯示14-3-3ε和GFA

6、P的表達(dá)有高度一致的亞細(xì)胞定位（胞質(zhì)），且在表達(dá)強(qiáng)度上兩者也具有高度的一致性：即14-3-3ε表達(dá)強(qiáng)的細(xì)胞內(nèi)也有高表達(dá)強(qiáng)度的GFAP。ε
　　結(jié)果二（體外機(jī)械劃傷模型結(jié)果）：①.造模后14-3-3ε和GFAP表達(dá)水平變化趨勢的關(guān)系：與缺糖缺氧/缺血-再灌注模型模型不同，機(jī)械劃傷模型中的14-3-3ε蛋白變化趨勢不明顯，各時間點之間蛋白水平變化無統(tǒng)計學(xué)差異；但GFAP的升高趨勢較為明顯，尤其是在48h可檢測到GFAP的顯著性增多。②

7、.造模后14-3-3ε和GFAP表達(dá)水平間的數(shù)量依存關(guān)系：線性相關(guān)分析結(jié)果顯示14-3-3和GFAP的表達(dá)水平存在顯著線性相關(guān)關(guān)系（R2=0.3119，P=0.009），線性回歸系數(shù)為0.3646，證實了GFAP與14-3-3表達(dá)水平之間存在數(shù)量依存關(guān)系；造模后14-3-3ε和GFAP的表達(dá)定位關(guān)系：免疫熒光染色同樣顯示14-3-3ε蛋白和GFAP在活化星形膠質(zhì)細(xì)胞中良好的共定位，具體表現(xiàn)包括造模后14-3-3ε和GFAP均表達(dá)增強(qiáng)（較

8、對照組）強(qiáng)度且同一時間點時，越靠近劃痕14-3-3和GFAP表達(dá)強(qiáng)度越高。
　　結(jié)論：目的蛋白14-3-3和星形膠質(zhì)細(xì)胞活化標(biāo)志物GFAP在損傷早期活化的星形膠質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá)增多，二者不僅表達(dá)變化趨勢相似，表達(dá)水平間也存在顯著的線性相關(guān)關(guān)系，并且在細(xì)胞中具有高度一致的亞細(xì)胞定位。因此，可以認(rèn)為損傷早期星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)源性表達(dá)14-3-3ε蛋白與星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化有關(guān)，14-3-3ε蛋白可能通過星形膠質(zhì)細(xì)胞活化從而在脊髓損傷中發(fā)揮相應(yīng)

9、的作用。
　　第二部分 14-3-3蛋白在SD大鼠脊髓損傷中的表達(dá)
　　目的：了解14-3-3蛋白和GFAP在脊髓損傷后的表達(dá)趨勢及相關(guān)關(guān)系
　　方法：利用Allen's模型造成成年SD大鼠T10節(jié)段的脊髓損傷，在損傷后4h、8h、16h、24h、3d、7d、14d和28d分別快速冰上取材或灌流取材，獲得以損傷處為中心的脊髓組織。通過免疫蛋白印跡和免疫熒光染色的方法，檢測活化AS標(biāo)志物GFAP和目的蛋白14-3-3的表

10、達(dá)變化，探究二者的相關(guān)性。
　　結(jié)果：①.脊髓損傷后14-3-3和GFAP表達(dá)水平變化趨勢的關(guān)系：與體外缺糖缺氧/缺血-再灌注造模類似，GFAP和14-3-3蛋白的表達(dá)在脊髓損傷早期（4h或8h）便開始明顯增多。14-3-3蛋白在SCI后最初的24小時呈現(xiàn)出較為顯著的上升趨勢，傷后7到28天的表達(dá)相對穩(wěn)定；而GFAP的表達(dá)隨著損傷時間的延長逐漸增加，且一直持續(xù)高表達(dá)至28d；兩者相比，14-3-3的上升平臺期先于GFAP出現(xiàn)。②.

11、脊髓損傷后14-3-3和GFAP表達(dá)水平間的數(shù)量依存關(guān)系：線性相關(guān)分析顯示14-3-3ε蛋白與GFAP的表達(dá)水平之間存在數(shù)量依存關(guān)系（線性回歸系數(shù)=0.6478，R2=0.7100，P＜0.001），證實了體內(nèi)實驗時GFAP與14-3-3表達(dá)水平之間也存在數(shù)量依存關(guān)系；脊髓損傷后14-3-3和GFAP的表達(dá)定位關(guān)系：免疫熒光染色結(jié)果顯示了14-3-3ε和GFAP在脊髓損傷后的脊髓組織中具有的良好的定位共性，包括造模組兩者的表達(dá)強(qiáng)度明顯高

12、于假手術(shù)組的表達(dá)強(qiáng)度、14-3-3表達(dá)強(qiáng)的組織部位也有高表達(dá)強(qiáng)度的GFAP等。
　　結(jié)論：SCI后14-3-3蛋白和GFAP表達(dá)在損傷周圍的脊髓組織中明顯增加，盡管14-3-3ε蛋白的變化先于GFAP達(dá)到平臺期，但二者在表達(dá)水平仍然存在顯著的線性相關(guān)關(guān)系、共同的變化趨勢以及一致的組織定位。在體實驗進(jìn)一步證實了脊髓損傷后早期14-3-3ε蛋白在脊髓中的高表達(dá)可能與星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化有關(guān)，其可能影響或參與星形膠質(zhì)細(xì)胞在損傷早期的活化。