內(nèi)皮素1在體外對喉癌HEP2細(xì)胞影響的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、內(nèi)皮素家族有三種異構(gòu)體：內(nèi)皮素1、內(nèi)皮素2、內(nèi)皮素3，其中內(nèi)皮素l的生物學(xué)活性最為多樣，研究也最充分。現(xiàn)已明確內(nèi)皮素1是含21個氨基酸的活性肽，與G蛋白偶聯(lián)受體A或者受體B受體結(jié)合后，可激活不同的信息通路，最終可發(fā)揮其生物學(xué)效應(yīng)。研究表明，內(nèi)皮素1的生物學(xué)效應(yīng)非常復(fù)雜，對氣道張力、離子運(yùn)輸、神經(jīng)傳遞、垂體功能、基因調(diào)控等均發(fā)揮影響。 最近又發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮素1對多種惡性腫瘤的病理發(fā)展同樣具有調(diào)控作用。國外多項(xiàng)研究證實(shí)，惡性腫瘤組織或者培

2、養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞存在內(nèi)皮素1或者受體的表達(dá)；在內(nèi)皮素受體的介導(dǎo)下，內(nèi)皮素1可以通過促進(jìn)細(xì)胞增殖、抑制凋亡、促進(jìn)血管生成、促進(jìn)細(xì)胞周圍侵潤及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等多種方式，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生及發(fā)展。 喉癌是頭頸部腫瘤中的高發(fā)疾病，占頭頸部腫瘤的13.9％，我國部分地區(qū)發(fā)病率約為1.5-3.4/10萬人，已成為嚴(yán)重威脅人民生命健康和生活質(zhì)量的疾病。相對于其它惡性腫瘤，內(nèi)皮素1與喉癌病理發(fā)展之間關(guān)系的研究并不充分，國外僅Shichiri等初步研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮

3、素1可以促進(jìn)喉癌細(xì)胞數(shù)量的增長，但惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展與細(xì)胞增殖、調(diào)亡、移行能力等密切相關(guān)，在喉癌病理發(fā)展過程中，內(nèi)皮素1在上述方面的具體作用仍然缺乏深入了解，這正是本課題擬予解決的。 目的: 1．明確內(nèi)皮素1、內(nèi)皮素受體在喉癌細(xì)胞中表達(dá)情況。 2．了解內(nèi)皮素1對喉癌細(xì)胞增殖的影響。 3．了解內(nèi)皮素1對喉癌細(xì)胞移行能力的影響。 4．了解內(nèi)皮素1對喉癌細(xì)胞凋亡的影響。 方法: 1．RT

4、 PCR方法檢測內(nèi)皮素1、內(nèi)皮素受體A、內(nèi)皮素受體B在人喉癌HEP 2細(xì)胞的基因表達(dá)；通過免疫組化ABC法研究內(nèi)皮素1、內(nèi)皮素受體A、內(nèi)皮素受體B在人喉癌HEP 2細(xì)胞爬片的蛋白表達(dá)。 2.細(xì)胞種植于96孔板(2×10<'3>細(xì)胞/孔)，5個濃度的內(nèi)皮素1(1×10<'-7>mol/L，1×10<'-8>mol/L、1×10<'-9>mol/L、1×10<'-10>mol/L、1×10<'-11>mol/L)分別處理人喉癌HEP

5、 2細(xì)胞，MTT方法檢測24小時、48小時、72小時、96小時的吸光度，觀察內(nèi)皮素1能否促進(jìn)細(xì)胞增殖。 3．按300個細(xì)胞/孔密度，將HEP2細(xì)胞接種于24孔板，3個濃度內(nèi)皮素1(1×10<'-7>mol/L、1×10<'-9>mol/L、1×10<'-11>mol/L)干預(yù)細(xì)胞48小時后，繼續(xù)培養(yǎng)10天，觀察克隆生成情況。 4．按3×10<'5>細(xì)胞/孔密度，將HEP 2細(xì)胞接種于6孔板，3個濃度內(nèi)皮素1(1×10<'

6、-7>mol/L、1×10<'-9>mol/L、1×10<'-11>mol/L)分別處理細(xì)胞48小時，采用劃痕實(shí)驗(yàn)方法觀察內(nèi)皮素1對喉癌細(xì)胞移行能力的影響。 5. 3個濃度內(nèi)皮素1(1×10<'-7>mol/L、1×10<'-9>mol/L、1×10<'-11>mol/L)分別處理細(xì)胞24、48小時后，觀察喉癌細(xì)胞凋亡指數(shù)的變化。 結(jié)果: 1．人喉癌HEP 2細(xì)胞采用內(nèi)皮素1、內(nèi)皮素受體A、內(nèi)皮素受體B和GAPD

7、H引物進(jìn)行PCR，均獲得陽性目的片斷，與預(yù)期片斷長度符合。內(nèi)皮素1擴(kuò)增片斷長度為129bp，內(nèi)皮素受體A擴(kuò)增片斷長度為175bp，內(nèi)皮素受體B擴(kuò)增片斷長度為130 bp，GAPDH擴(kuò)增片斷長度為141bp。 2．光學(xué)顯微鏡下觀察，人喉癌HEP 2細(xì)胞漿內(nèi)見內(nèi)皮素1棕黃色免疫反應(yīng)顆粒沉著；內(nèi)皮素受體A、內(nèi)皮素受體B亦見免疫陽性反應(yīng)，免疫反應(yīng)主要分布于細(xì)胞膜。 3．MTT法顯示，1×10<'-7>mol/L,濃度內(nèi)皮素1作用

8、喉癌HEP 2細(xì)胞后，可以明顯促進(jìn)喉癌HEP 2細(xì)胞增殖，而1×10<'-11>～1×10<'-8>mol/L濃度組的內(nèi)皮素1對喉癌細(xì)胞HEP 2的增殖沒有作用。 4．內(nèi)皮素1干預(yù)喉癌HEP 2細(xì)胞48小時，并繼續(xù)培養(yǎng)十天后，內(nèi)皮素1(1×10<'-7>mol/L濃度)處理組細(xì)胞集落體積大，細(xì)胞克隆數(shù)為59.0±2.00；1×10<'-9>mol/L濃度組克隆數(shù)為32.6±1.15，1×10<'-11>mol/L濃度組克隆數(shù)為3

9、0.6±2.08，對照組為31.0±1.00。內(nèi)皮素1(1×10<'-7>mol/L濃度)組與對照組比較，有顯著性差異。 5．1×10<'-7>mol/L、1×10<'-9>mol/L、1×10<'-11>mol/L濃度內(nèi)皮素1處理細(xì)胞48小時后，明顯促進(jìn)喉癌HEP 2細(xì)胞的移行，其中對照組移行細(xì)胞數(shù)為8.00±1.00，內(nèi)皮素1各處理組(1×10<'-7>mol/L、1×10<'-9>mol/L、1×10<'-11>mol/L

10、)分別為21.6±1.57、17.3±1.52、15.6±2.08，與對照組比較，各個內(nèi)皮素1濃度組均有顯著性差異。 6．流式檢測顯示，內(nèi)皮素1處理24、48小時后，各內(nèi)皮素1濃度組與對照組、各內(nèi)皮素1濃度組間細(xì)胞凋亡率(AI)均無顯著性差異。 結(jié)論: 1．人喉癌HEP 2細(xì)胞存在內(nèi)皮素1、內(nèi)皮素受體A和內(nèi)皮素受體B基因及蛋白表達(dá)。 2．內(nèi)皮素1可以促進(jìn)人喉癌HEP 2細(xì)胞增殖，并且與內(nèi)皮素1的濃度高低相