Sertoli細(xì)胞促進(jìn)神經(jīng)前體細(xì)胞分化信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)分子作用機(jī)理研究.pdf

1、很多研究將Sertoli細(xì)胞在神經(jīng)前體細(xì)胞分化中的作用歸結(jié)為Sertoli細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子和營(yíng)養(yǎng)因子等分泌物上，而從Notch信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)角度，通過(guò)Noch受體與配體的相互作用，來(lái)探討細(xì)胞與細(xì)胞間的相互接觸在神經(jīng)前體細(xì)胞分化中的意義，國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)報(bào)道。因而我們從Notch信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)分子方面，對(duì)Sertoli細(xì)胞在神經(jīng)前體細(xì)胞分化作用機(jī)理進(jìn)行了深入研究?，F(xiàn)將四部分內(nèi)容分述如下： 第一部分：大鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)前體細(xì)胞的分離培養(yǎng)及其

2、增殖分化特性鑒定 目的：神經(jīng)前體細(xì)胞是一類具有多向分化潛能和自我復(fù)制能力，在特定條件下，能夠向特定類型神經(jīng)元或神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞分化的細(xì)胞。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)體外分離和培養(yǎng)大鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)前體細(xì)胞，對(duì)神經(jīng)前體細(xì)胞增殖和分化特性進(jìn)行鑒定。 方法：分離2周齡大鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)前體細(xì)胞，在含EGF、bFGF和GDNF的NSC培養(yǎng)基中進(jìn)行體外培養(yǎng)，使用免疫細(xì)胞熒光染色技術(shù)對(duì)細(xì)胞的分化特性進(jìn)行鑒定。 結(jié)果：誘導(dǎo)神經(jīng)前體細(xì)胞增殖的有絲裂原包

3、括堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子和表皮生長(zhǎng)因子等。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明EGF、bFGF和GDNF可促進(jìn)神經(jīng)前體細(xì)胞的增殖及神經(jīng)球的克隆形成，并獲得了Nestin陽(yáng)性的神經(jīng)前體細(xì)胞，其可分化為分別表達(dá)β-Ⅲ tubulin、GFAP和GalC的陽(yáng)性細(xì)胞。 結(jié)論：神經(jīng)前體細(xì)胞在體外大量擴(kuò)增后，植入腦組織內(nèi)或通過(guò)基因重組后再植入腦內(nèi)，可用來(lái)治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病，如帕金森病或阿爾茨海默病。中樞神經(jīng)系統(tǒng)中神經(jīng)前體細(xì)胞的增殖與分化是一個(gè)復(fù)雜的進(jìn)程，存在細(xì)

4、胞自身基因調(diào)控和外來(lái)信號(hào)調(diào)控兩種機(jī)制。因而，目前需要積極尋找可靠的方法來(lái)有效地分離和擴(kuò)增神經(jīng)前體細(xì)胞，并精確地了解其增殖與分化特性。本研究第一部分利用大鼠的大腦皮質(zhì)分離培養(yǎng)神經(jīng)前體細(xì)胞，觀察了bFGF、EGF和GDNF三種生長(zhǎng)因子對(duì)神經(jīng)前體細(xì)胞在體外培養(yǎng)增殖和分化的影響，體外分離和培養(yǎng)的大腦皮質(zhì)神經(jīng)前體細(xì)胞，在含EGF、bFOF和GDNF的NSC培養(yǎng)基中培養(yǎng)，具有不斷增殖和多向分化的能力，符合神經(jīng)前體細(xì)胞的特點(diǎn)，為神經(jīng)前體細(xì)胞的定向分化

5、研究奠定了基礎(chǔ)。 第二部分：Sertoli細(xì)胞對(duì)大鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)前體細(xì)胞的誘導(dǎo)分化作用研究 目的：同一來(lái)源的神經(jīng)前體細(xì)胞移植到不同部位后，其分化結(jié)果也不相同，但往往與接受移植部位的細(xì)胞相似，提示外來(lái)信號(hào)調(diào)控作用的重要性。而且，在不同因素影響下，神經(jīng)干細(xì)胞還具有橫向分化潛能。本部分主要研究Sertoli細(xì)胞對(duì)體外培養(yǎng)大鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)前體細(xì)胞生長(zhǎng)分化的作用特點(diǎn)，及向多巴胺能神經(jīng)元分化的誘導(dǎo)作用。 方法：將大鼠Sert

6、oli細(xì)胞與14d大鼠皮質(zhì)神經(jīng)前體細(xì)胞體外共培養(yǎng)，免疫組化檢測(cè)神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)記物Nestin，神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物β-Ⅲ tubulin、GFAP和GalC，及多巴胺能神經(jīng)元標(biāo)記物酪氨酸羥化酶(TH)的表達(dá)情況。 結(jié)果：隨著共培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，神經(jīng)干細(xì)胞中GFAP陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量逐漸減少，而β-Ⅲ tubulin陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)增多，并出現(xiàn)TH陽(yáng)性的神經(jīng)元。 結(jié)論：把胎鼠或成年鼠前腦神經(jīng)干細(xì)胞移植給經(jīng)亞致死量照射破壞

7、了造血系統(tǒng)的同種宿主的骨髓，發(fā)現(xiàn)后者出現(xiàn)了供者源性的骨髓樣細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和早期的造血干細(xì)胞；把從人胚胎和成年小鼠快速分離的神經(jīng)干細(xì)胞與成肌細(xì)胞共培養(yǎng)，結(jié)果神經(jīng)前體細(xì)胞分化為骨骼肌細(xì)胞。證實(shí)了神經(jīng)干細(xì)胞有著更大的分化潛能。Clarke等發(fā)現(xiàn)，成年鼠腦的干細(xì)胞能在雞胚環(huán)境中被誘導(dǎo)形成所有的胚層。這些研究結(jié)果顯示，環(huán)境的指導(dǎo)性信號(hào)對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞分化的重要作用。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：Sertoli細(xì)胞抑制體外培養(yǎng)的大鼠皮質(zhì)神經(jīng)前體細(xì)胞的生長(zhǎng)，但具有

8、顯著的促神經(jīng)元分化的作用，并能夠誘導(dǎo)與其共培養(yǎng)的大鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)前體細(xì)胞分化為多巴胺能神經(jīng)元。 第三部分：Sertoli細(xì)胞共培養(yǎng)大鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)前體細(xì)胞分化中Notch信號(hào)相關(guān)基因表達(dá)分析 目的：對(duì)那些在發(fā)育期調(diào)控細(xì)胞決定和細(xì)胞分化的基因進(jìn)行了深入研究，發(fā)現(xiàn)Notch信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是具備這些功能的重要家族之一。它在大量的組織和器官的發(fā)育中發(fā)揮重要作用，調(diào)控著組織類型及形態(tài)的發(fā)生。本部分研究主要檢測(cè)與Srtoli細(xì)胞共培養(yǎng)

9、條件下大鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)前體細(xì)胞分化過(guò)程中Notch信號(hào)相關(guān)分子的表達(dá)變化，分析Notch信號(hào)途徑在神經(jīng)前體細(xì)胞分化過(guò)程中的可能作用。 方法：本實(shí)驗(yàn)通過(guò)神經(jīng)前體細(xì)胞與Srtoli細(xì)胞共培養(yǎng)，用Real-timePCR相對(duì)定量法，以β-actin為內(nèi)對(duì)照，分別檢測(cè)Notch受體Notch1、Notch2、Notch3、Notch4，及其酉己體Delta1、Delta3、Jagged1、Jagged2，以及Hes 1、Ngn1基因的表

10、達(dá)變化。 結(jié)論：在干細(xì)胞發(fā)育過(guò)程中，細(xì)胞膜表面分子Notch通過(guò)結(jié)合其配體Delta或Jagged而在干細(xì)胞和周圍細(xì)胞間傳遞信號(hào)，這種細(xì)胞間的相互作用可以調(diào)控干細(xì)胞的分化。在哺乳動(dòng)物，Notct1信號(hào)通過(guò)CBF 激活E(sp1)的同源物Hes[Hairy and E(sp1)]1/5，并影響Ngn(Neurogeilins)等前神經(jīng)因子的表達(dá)，從而調(diào)節(jié)神經(jīng)干細(xì)胞的分化。Notch在細(xì)胞間傳導(dǎo)相互作用的信號(hào)，并通過(guò)這種鄰近細(xì)胞間的

11、信號(hào)傳遞來(lái)精確調(diào)控各譜系細(xì)胞分化。Notch信號(hào)通路在哺乳動(dòng)物CNS發(fā)育中參與神經(jīng)發(fā)生過(guò)程，決定著CNS祖細(xì)胞是選擇繼續(xù)增殖還是向神經(jīng)元分化。一般而言，Notch信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活維持神經(jīng)干細(xì)胞的穩(wěn)定狀態(tài)，抑制定向分化：但另一方面，也有證據(jù)表明激活Notch信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路又可以加速并不可逆地促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞向成膠質(zhì)細(xì)胞分化。本研究。 第三部分應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法，檢測(cè)了與sertoli細(xì)胞共培養(yǎng)神經(jīng)前體細(xì)胞分化過(guò)程中Notch相

12、關(guān)基因Notch1～4、Delta1、Delta3、Jagged1、Jagged2、hes1和ngn1的表達(dá)變化，實(shí)驗(yàn)表明在與sertoli細(xì)胞共培養(yǎng)條件下，神經(jīng)前體細(xì)胞的分化特點(diǎn)與Notch信號(hào)相關(guān)分子的表達(dá)變化相關(guān)。Sertoli細(xì)胞可通過(guò)N0tch配體的作用，調(diào)節(jié)神經(jīng)前體細(xì)胞N0tch信號(hào)分子的表達(dá)。在共培養(yǎng)條件下，Sertoli細(xì)胞對(duì)神經(jīng)前體細(xì)胞Hesl表達(dá)有抑制作用，但對(duì)Ngn1有正向調(diào)節(jié)作用，從而影響神經(jīng)前體細(xì)胞的分化。

13、 第四部分：Hes1基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建及瞬時(shí)表達(dá)在大腦皮質(zhì)神經(jīng)前體細(xì)胞分化中的作用 目的：隨著神經(jīng)前體細(xì)胞分離、提純及體外培養(yǎng)等研究的深入，對(duì)內(nèi)在和外在因子控制神經(jīng)前體細(xì)胞增殖和分化的研究也取得了顯著進(jìn)步。目前研究證明，發(fā)生在不同組織內(nèi)的同一機(jī)制調(diào)控著該關(guān)鍵步驟，而其中涉及最多者為bHLH基因家族。bHLH是一組轉(zhuǎn)錄因子，通過(guò)一個(gè)堿性區(qū)域和一個(gè)HLH域的異二聚化與DNA形成特定的接觸。Notch信號(hào)的下游基因E(sp1)

14、Htes就是其中之一。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)克隆大鼠Hes1基因并構(gòu)建真核表達(dá)載體pCDNA3.1-Hes1，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染大鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)前體細(xì)胞，獲得高表達(dá)Hesl基因的神經(jīng)前體細(xì)胞克隆。以探討Hes1基因高表達(dá)對(duì)神經(jīng)前體細(xì)胞分化的影響。 方法：從大鼠腦組織中提取總RNA，用RT-PCR方法獲得Hes1基因的全長(zhǎng)cDNA，插入pGEM-T-Easy克隆載體中進(jìn)行序列測(cè)定，測(cè)序正確后將其亞克隆至表達(dá)載體pCDNA3.1，利用脂質(zhì)體將重組質(zhì)

15、粒轉(zhuǎn)染原代培養(yǎng)的神經(jīng)前體細(xì)胞，經(jīng)G418篩選獲得抗性細(xì)胞克隆，采用RT-PCR方法鑒定Hesl基因在神經(jīng)前體細(xì)胞基因組中的存在，實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)Hes1基因的過(guò)表達(dá)情況。 結(jié)果：經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切圖譜分析和DNA序列測(cè)定證實(shí)目的基因己插入重組質(zhì)粒，RT-PCR證明經(jīng)G418篩選得到的轉(zhuǎn)基因神經(jīng)前體細(xì)胞克隆的基因組DNA中存在Hes1基因，實(shí)時(shí)熒光定量PCR進(jìn)一步證明轉(zhuǎn)基因神經(jīng)前體細(xì)胞Hes1基因的mRNA呈高表達(dá)。

16、 結(jié)論：不同的bHLH因子具有不同的決定和分化的功能，經(jīng)常作為一個(gè)相關(guān)蛋白質(zhì)家族而存在，按時(shí)空順序短暫表達(dá)于細(xì)胞系分化的不同階段。早期表達(dá)因子參與祖細(xì)胞的決定，而晚期表達(dá)因子則參與分裂細(xì)胞的終期分化，早期表達(dá)蛋白質(zhì)激活晚期蛋白質(zhì)表達(dá)。研究顯示，Notch和它的下游效應(yīng)器Hes基因，以及同源基因Emx2具有維持腦內(nèi)多潛能干細(xì)胞狀態(tài)的功能，而Ngn1/2和Mash1和Pax6是神經(jīng)前體細(xì)胞向神經(jīng)元分化的必要條件。Kabos等發(fā)現(xiàn)阻斷Hesl

17、表達(dá)促進(jìn)中樞神經(jīng)干細(xì)胞分化為γ-氨基丁酸神經(jīng)元。神經(jīng)元形成后，Hes因子的激活促進(jìn)星形膠質(zhì)細(xì)胞的分化，而前神經(jīng)bHLH因子Ngn抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞的分化。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)克隆大鼠Hes1基因，構(gòu)建真核表達(dá)載體pCDNA3.1-Hes 1，并將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染大鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)前體細(xì)胞，研究觀察了Hes 1基因過(guò)表達(dá)對(duì)神經(jīng)前體細(xì)胞Ngn1表達(dá)的影響，以及這些變化在神經(jīng)前體細(xì)胞分化的作用。實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建了大鼠Hes 1基因的真核表達(dá)載體，獲得了穩(wěn)定表達(dá)He