2023年全國碩士研究生考試考研英語一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁
已閱讀1頁,還剩157頁未讀, 繼續(xù)免費閱讀

下載本文檔

版權說明:本文檔由用戶提供并上傳,收益歸屬內容提供方,若內容存在侵權,請進行舉報或認領

文檔簡介

1、在哺乳動物基因組中,存在著大量具有低蛋白表達能力的RNA長轉錄本—長鏈非編碼RNA(long noncoding RNA,lncRNAs),它的長度一般在200 nt以上,具有相對保守的二級結構、一定的亞細胞定位和剪接形式,其種類、數(shù)量及作用機制尚不完全明確。lncRNAs在宿主與病毒博弈過程中廣泛存在,Yin等通過全轉錄本測序發(fā)現(xiàn)SARS冠狀病毒感染的小鼠體內、IAV感染的人肺上皮細胞中和EV71感染的RD細胞中均存在差異表達的長鏈非

2、編碼RNA。其中有些病毒可以通過與lncRNAs相互作用來調節(jié)宿主和/或病毒的基因表達,從而影響病毒自身的潛伏或復制;有些lncRNAs能夠協(xié)助病毒復制,幫助其逃離免疫監(jiān)視,抑制抗病毒免疫。由此可見 lncRNAs在病毒感染及抗病毒免疫中發(fā)揮著重要作用。然而,在病毒感染疾病中只有部分lncRNAs的功能得到了詳細研究。
  呼吸道合胞病毒(RSV)是有包膜的單股負鏈RNA病毒,是引起嬰幼兒呼吸道病毒感染的重要病原體之一;在RSV引

3、起的上呼吸道感染中,25~40%會合并更為嚴重的下呼吸道感染,導致毛細支氣管炎或肺炎。那么在 RSV與宿主細胞博弈過程中是否有 lncRNAs的參與呢?我們在Johnmattick構建的lncRNAdb數(shù)據(jù)庫中檢索到了4條與RNA病毒或呼吸道病毒感染有關的lncRNAs,包括NEAT1,PRINS,NEST和NRAV。通過RSV感染驗證實驗,發(fā)現(xiàn)只有長鏈非編碼RNA NRAV的表達量與假感染組有差異。有關 NRAV表達與病毒感染之關系,

4、歐陽晶等曾發(fā)現(xiàn)在甲型流感病毒、仙臺病毒、呼腸孤病毒和單純皰疹病毒感染呼吸道上皮細胞時NRAV表達下調,并且NRAV能夠通過抑制細胞ISG基因轉錄促進病毒復制。
  長鏈非編碼RNA功能廣泛,可以在DNA、RNA或蛋白質水平上分別或同時發(fā)揮調節(jié)作用。其調控機制之一—競爭性內源RNA(competitive endogenous RNA, ceRNA)表明,細胞內存在著一種以miRNA為樞紐的轉錄后調控網絡,如果lncRNAs和蛋白質

5、編碼基因的mRNA可以共享相同的miRNA反應原件(MRE),lncRNAs就可以通過結合 miRNA,起到對miRNA控制的下游靶基因表達增強或減弱的間接調控作用,故也將具有ceRNA作用的lncRNAs稱為“分子海綿”??紤]到lnc-NRAV在細胞中的定位主要是細胞漿,而胞漿也是成熟miRNA的分布區(qū)域,在本研究中,我們以呼吸道上皮細胞A549和BEAS-2B細胞作為RSV的感染模型,以胞漿 lnc-NRAV及其調控的下游 miRN

6、A、靶基因為研究對象,深入探討了lnc-NRAV對RSV感染的影響,進一步豐富了對lncRNAs與呼吸道感染病毒相互關系的了解。
  第一部分:RSV感染對呼吸道上皮細胞 lnc-NRAV表達的影響及l(fā)nc-NRAV對病毒增殖的調節(jié)作用
  目的:
  通過qRT-PCR驗證RSV感染細胞長鏈非編碼RNA NEAT1、PRINS、NEST和NRAV的表達情況;利用生物信息學手段,了解長鏈RNA NRAV的蛋白質編碼能力

7、和序列保守性;通過qRT-PCR,探討RSV感染對A549和BEAS-2B細胞lnc-NRAV表達的影響;通過敲低或過表達細胞中l(wèi)nc-NRAV的表達量,探討lnc-NRAV對病毒增殖可能的影響。
  方法:
  1.RSV(MOI=3)感染A549細胞后12h、24h、36h,qRT-PCR檢測長鏈非編碼RNA NEAT1、PRINS、NEST和NRAV的表達情況。
  2.根據(jù)上一步的檢測結果,只有長鏈RNA NR

8、AV在RSV感染的A549細胞中有表達變化。故使用 LNCipedia、UCSC數(shù)據(jù)庫分析長鏈RNA NRAV的蛋白質編碼能力、二級結構和序列保守性。
  3.以感染復數(shù)MOI=3的RSV病毒感染A549或BEAS-2B細胞28h,每2h收取一次細胞總RNA,qRT-PCR檢測lnc-NRAV表達量。
  4.在過表達 lnc-NRAV的細胞中感染 RSV,感染后第4~28h每4h收取一次細胞總RNA,qRT-PCR檢測RS

9、V NS1、N、F、G、M、M2基因的相對表達量;在感染后第24h、48h、72h收取細胞總蛋白,Western blot檢測RSVF蛋白的表達量;在感染后第24~48h每4h收取一次細胞上清,病毒空斑試驗檢測細胞上清中RSV病毒滴度的變化情況。
  5.在敲低lnc-NRAV的細胞中感染RSV,在感染后第4~28h每4h收取細胞總RNA,qRT-PCR檢測RSV相關基因的相對表達量;在感染后第24h、48h、72h收取細胞總蛋白

10、,Western blot檢測RSV F蛋白的表達量;在感染后第24h~48h每4h收取一次細胞上清,病毒空斑試驗檢測細胞上清中RSV病毒滴度的變化情況。
  結果:
  1.lnc-NRAV在 RSV感染 A549(MOI=3)第24h、36h表達下降(P<0.05);lncRNA NEAT1、PRINS、NEST的表達無明顯變化(P>0.05)。
  2.lnc-NRAV不具備編碼蛋白質的功能,具有由多個莖環(huán)結構組

11、成的二級結構,與小鼠等其他脊椎動物同源性較低。
  3.RSV感染A54920h后,lnc-NRAV的表達量逐漸下降(P<0.05);RSV感染BEAS-2B8h后,lnc-NRAV的表達量逐漸下降(P<0.05)。
  4.在細胞中,上調lnc-NRAV的表達能夠促進RSV的復制。
  在過表達lnc-NRAV的細胞中感染RSV,RSV相關基因的相對表達量明顯高于對照組(P<0.05),RSVF蛋白表達量明顯高于對照

12、組(P<0.05),細胞上清中RSV病毒滴度高于對照組(P<0.05)。
  5.在細胞中,下調lnc-NRAV的含量能夠抑制RSV的復制。
  在敲低lnc-NRAV的細胞中感染RSV,RSV相關基因的表達量明顯低于對照組(P<0.05);RSVF蛋白表達量明顯低于對照組(P<0.05);細胞上清中RSV病毒滴度低于對照組(P<0.05)。
  第二部分:lnc-NRAV結合miR-125a/b-5p的預測及驗證

13、r>  目的:
  利用生物信息學手段,預測 lnc-NRAV是否具有結合 miRNA的潛力;通過雙熒光素酶報告試驗、過表達 lnc-NRAV或 lnc-NRAVmut及回復試驗,驗證在呼吸道上皮細胞中l(wèi)nc-NRAV通過不完全互補配對結合miRNA的可能性。
  方法:
  1.使用miRDB數(shù)據(jù)庫預測lnc-NRAV結合miRNA的潛力。
  2.將野生型lnc-NRAV序列插入雙熒光素酶報告載體pmirGL

14、O的多克隆位點,構建雙熒光素酶報告質粒pmirGLO-NRAV。將突變型lnc-NRAV序列插入pmirGLO的多克隆位點,構建雙熒光素酶報告質粒pmirGLO-NRAVmut。在A549或BEAS-2B細胞中,將pmir-GLO、pmir-GLO-NRAV或pmir-GLO-NRAVmut與miR-125 mimics共轉染,通過雙熒光素酶報告試驗檢測lnc-NRAV通過不完全互補配對結合miRNA的可能性。
  3.在細胞中過

15、表達或敲低miR-125a/b-5p,檢測lnc-NRAV的表達量。
  4.構建突變型lnc-NRAV過表達質粒pcDNA3.1-NRAVmut。在A549或BEAS-2B細胞中過表達野生型或突變型lnc-NRAV,檢測細胞中游離miR-125a-5p與miR-125b-5p的含量。
  5.在細胞中過表達lnc-NRAV、lnc-NRAVmut,或過表達lnc-NRAV的同時過表達miR-125a/b-5p,RSV感染后

16、48h收取細胞總RNA,經qRT-PCR檢測RSV相關基因的相對表達量;收取細胞總蛋白,Western blot檢測RSV F蛋白的表達量;收取細胞上清,病毒空斑試驗檢測細胞上清中RSV病毒滴度的變化情況。
  6.在細胞中敲低lnc-NRAV,或敲低lnc-NRAV的同時敲低 miR-125a/b-5p,RSV感染后48h收取細胞總RNA,經qRT-PCR檢測RSV相關基因的相對表達量;收取細胞總蛋白,Western blot檢

17、測RSV F蛋白的表達量;收取細胞上清,病毒空斑試驗檢測細胞上清中RSV病毒滴度的變化情況。
  結果:
  1.在A549或BEAS-2B中,lnc-NRAV可以通過不完全互補配對結合miR-125a/b-5p。
  2.在細胞中過表達或敲低miR-125a/b-5p,lnc-NRAV的表達量與對照組相比無明顯變化(P>0.05)。
  3.過表達野生型lnc-NRAV,細胞中游離miR-125a-5p與miR

18、-125b-5p的含量下降(P<0.05),促進病毒復制。過表達突變型lnc-NRAV,miR-125a-5p與miR-125b-5p含量與對照組相比無明顯變化(P>0.05),對病毒復制無影響。
  4.過表達lnc-NRAV的同時過表達miR-125a/b-5p,或者在敲低lnc-NRAV的同時敲低miR-125a/b-5p,會使呼吸道上皮細胞中RSV產量回復到對照組水平。
  第三部分:lnc-NRAV間接調控的ceR

19、NA環(huán)路靶mRNA的預測及驗證
  目的:
  利用生物信息學手段,預測miR-125a/b-5p可能的靶基因,通過雙熒光素酶報告試驗驗證預測結果;在 RSV感染的呼吸道上皮細胞A549或BEAS-2B中,驗證lnc-NRAV與miR-125參與的ceRNA環(huán)路中的可能靶mRNA。
  方法:
  1.利用Targetscan、miRDB和microRNA三個生物信息學數(shù)據(jù)庫共同預測miR-125a-5p、miR

20、-125b-5p的靶基因,根據(jù)預測結果的交集選擇可能的靶 mRNA。根據(jù)預測結果,miR-125a/b-5p可能的靶基因有 IL-6R、IRF4、IL-31、CD5L、IL-16、CXCL13。通過qRT-PCR檢測了A549和BEAS-2B細胞中以上預測基因的表達量,因結果提示,只有IL6-R在A549和BEAS-2B細胞中有表達,故后續(xù)試驗圍繞IL-6R設計進行。
  2.構建雙熒光素酶報告質粒pmirGLO-IL-6R。在細

21、胞中轉染pmirGLO-IL-6R的同時分別共轉染 pcDNA3.1、pcDNA3.1-NRAV或pcDNA3.1-NRAVmut,在回復試驗中共轉染 pmirGLO-IL-6R與pcDNA3.1-NRAV的同時轉染miR-125a mimics或miR-125b mimics,檢測各組熒光素酶的表達量。
  3.在細胞中轉染pmirGLO-IL-6R的同時敲低lnc-NRAV,在回復試驗中共轉染pmirGLO-IL-6R與si-

22、NRAV的同時轉染miR-125a inhibitor或miR-125b inhibitor,檢測各組熒光素酶的表達量。
  4.過表達lnc-NRAV、lnc-NRAVmut,或過表達lnc-NRAV的同時過表達miR-125a/b-5p,收取細胞總RNA,通過qRT-PCR檢測各組IL-6R相對表達量;收取細胞總蛋白,Western blot測各組IL-6R的表達量。
  5.敲低lnc-NRAV或敲低lnc-NRAV的

23、同時敲低miR-125a/b-5p,收取細胞總RNA,通過qRT-PCR檢測各組IL-6R相對表達量;收取細胞總蛋白,Western blot測各組IL-6R的表達量。
  6.過表達miR-125a/b-5p或過表達 miR-125a/b-5p的同時過表達lnc-NRAV,收取細胞總RNA,通過qRT-PCR檢測各組IL-6R相對表達量;收取細胞總蛋白,Western blot測各組IL-6R的表達量。
  7.過表達ln

24、c-NRAV、lnc-NRAVmut、IL-6R或過表達lnc-NRAV、lnc-NRAVmut的同時敲低IL-6R的A549或BEAS-2B細胞感染RSV,感染后48h,收取細胞總RNA,經qRT-PCR檢測RSV相關基因相對表達量;收取細胞總蛋白,Western blot檢測RSV F蛋白的表達量;收取細胞上清,病毒空斑試驗檢測細胞上清中RSV病毒滴度的變化情況。
  8.敲低lnc-NRAV、IL-6R或敲低lnc-NRAV

25、的同時過表達IL-6R的細胞感染RSV,感染后48h,收取細胞總RNA,經qRT-PCR檢測RSV相關基因相對表達量;收取細胞總蛋白,Western blot檢測RSVF蛋白的表達量;收取細胞上清,病毒空斑試驗檢測細胞上清中RSV病毒滴度的變化情況。
  結果:
  1.Targetscan、miRDB和microRNA三個數(shù)據(jù)庫預測,miR-125a-5p與miR-125b-5p下游靶基因中交集度及評分值較高的有IL-6R

26、、IRF4、IL-31、CD5L、IL-16、CXCL13。以qRT-PCR驗證,IL6-R Ct值為28-29,在A549和BEAS-2B細胞中有表達,其余基因Ct值>40(undetected),在細胞中未檢出。故后續(xù)試驗圍繞IL-6R設計進行。
  2.雙熒光素酶報告試驗結果提示,在細胞中l(wèi)nc-NRAV和IL-6R均可競爭性地結合miR-125a-5p和miR-125b-5p。
  3.lnc-NRAV和IL-6R的

27、表達量呈正相關,均起到促進RSV病毒復制的作用:
  3.1.過表達lnc-NRAV組IL-6R的相對表達量明顯高于對照組(P<0.05),過表達 lnc-NRAVmut組IL-6R的相對表達量與對照組相比無明顯差別(P>0.05)。在回復試驗中,過表達lnc-NRAV的同時過表達miR-125a-5p或miR-125b-5p,IL-6R的相對表達量與對照組相比無明顯差別(P>0.05)。
  3.2.敲低lnc-NRAV組

28、IL-6R的表達量明顯低于對照組(P<0.05)。在回復試驗中,同時敲低lnc-NRAV、miR-125a/b-5p,IL-6R的表達量回復至對照組水平(P>0.05)。
  3.3.過表達miR-125a/b-5p組IL-6R的表達量明顯低于對照組(P<0.05)。在回復試驗中,同時過表達miR-125a/b-5p與lnc-NRAV,IL-6R的表達量回復至對照組水平(P>0.05)。
  3.4.在以上過表達細胞中感染R

29、SV,結果顯示,過表達lnc-NRAV組、過表達IL-6R組RSV相關基因、F蛋白表達量及上清中病毒滴度明顯高于對照組(P<0.05),而過表達lnc-NRAVmut組則與對照組相比無明顯差別(P>0.05);在回復試驗中,過表達 lnc-NRAV的同時敲低IL-6R,RSV以上指標與對照組相比無明顯差別(P>0.05),而過表達lnc-NRAVmut的同時敲低IL-6R,RSV的增殖明顯低于對照組(P<0.05)。
  3.5.

30、在分別敲低lnc-NRAV、IL-6R的細胞中感染RSV,結果顯示RSV相關基因、F蛋白的表達量及上清中病毒滴度均明顯低于對照組(P<0.05);在回復試驗中,敲低lnc-NRAV的同時過表達IL-6R,則RSV的增殖回復至對照組水平(P>0.05)。
  結論:
  1.RSV感染引起呼吸道上皮細胞lnc-NRAV的表達下降。
  2.在呼吸道上皮細胞中上調lnc-NRAV能夠促進RSV在其中的復制;下調lnc-NR

溫馨提示

  • 1. 本站所有資源如無特殊說明,都需要本地電腦安裝OFFICE2007和PDF閱讀器。圖紙軟件為CAD,CAXA,PROE,UG,SolidWorks等.壓縮文件請下載最新的WinRAR軟件解壓。
  • 2. 本站的文檔不包含任何第三方提供的附件圖紙等,如果需要附件,請聯(lián)系上傳者。文件的所有權益歸上傳用戶所有。
  • 3. 本站RAR壓縮包中若帶圖紙,網頁內容里面會有圖紙預覽,若沒有圖紙預覽就沒有圖紙。
  • 4. 未經權益所有人同意不得將文件中的內容挪作商業(yè)或盈利用途。
  • 5. 眾賞文庫僅提供信息存儲空間,僅對用戶上傳內容的表現(xiàn)方式做保護處理,對用戶上傳分享的文檔內容本身不做任何修改或編輯,并不能對任何下載內容負責。
  • 6. 下載文件中如有侵權或不適當內容,請與我們聯(lián)系,我們立即糾正。
  • 7. 本站不保證下載資源的準確性、安全性和完整性, 同時也不承擔用戶因使用這些下載資源對自己和他人造成任何形式的傷害或損失。

最新文檔

評論

0/150

提交評論