長鏈非編碼RNA NRAV對RSV細胞內增殖的影響及機制研究.pdf

1、在哺乳動物基因組中，存在著大量具有低蛋白表達能力的RNA長轉錄本—長鏈非編碼RNA（long noncoding RNA，lncRNAs），它的長度一般在200 nt以上，具有相對保守的二級結構、一定的亞細胞定位和剪接形式，其種類、數(shù)量及作用機制尚不完全明確。lncRNAs在宿主與病毒博弈過程中廣泛存在，Yin等通過全轉錄本測序發(fā)現(xiàn)SARS冠狀病毒感染的小鼠體內、IAV感染的人肺上皮細胞中和EV71感染的RD細胞中均存在差異表達的長鏈非

2、編碼RNA。其中有些病毒可以通過與lncRNAs相互作用來調節(jié)宿主和/或病毒的基因表達，從而影響病毒自身的潛伏或復制；有些lncRNAs能夠協(xié)助病毒復制，幫助其逃離免疫監(jiān)視，抑制抗病毒免疫。由此可見 lncRNAs在病毒感染及抗病毒免疫中發(fā)揮著重要作用。然而，在病毒感染疾病中只有部分lncRNAs的功能得到了詳細研究。
　　呼吸道合胞病毒（RSV）是有包膜的單股負鏈RNA病毒，是引起嬰幼兒呼吸道病毒感染的重要病原體之一；在RSV引

3、起的上呼吸道感染中，25～40％會合并更為嚴重的下呼吸道感染，導致毛細支氣管炎或肺炎。那么在 RSV與宿主細胞博弈過程中是否有 lncRNAs的參與呢？我們在Johnmattick構建的lncRNAdb數(shù)據(jù)庫中檢索到了4條與RNA病毒或呼吸道病毒感染有關的lncRNAs，包括NEAT1，PRINS，NEST和NRAV。通過RSV感染驗證實驗，發(fā)現(xiàn)只有長鏈非編碼RNA NRAV的表達量與假感染組有差異。有關 NRAV表達與病毒感染之關系，

4、歐陽晶等曾發(fā)現(xiàn)在甲型流感病毒、仙臺病毒、呼腸孤病毒和單純皰疹病毒感染呼吸道上皮細胞時NRAV表達下調，并且NRAV能夠通過抑制細胞ISG基因轉錄促進病毒復制。
　　長鏈非編碼RNA功能廣泛，可以在DNA、RNA或蛋白質水平上分別或同時發(fā)揮調節(jié)作用。其調控機制之一—競爭性內源RNA（competitive endogenous RNA, ceRNA）表明，細胞內存在著一種以miRNA為樞紐的轉錄后調控網絡，如果lncRNAs和蛋白質

5、編碼基因的mRNA可以共享相同的miRNA反應原件（MRE），lncRNAs就可以通過結合 miRNA，起到對miRNA控制的下游靶基因表達增強或減弱的間接調控作用，故也將具有ceRNA作用的lncRNAs稱為“分子海綿”?？紤]到lnc-NRAV在細胞中的定位主要是細胞漿，而胞漿也是成熟miRNA的分布區(qū)域，在本研究中，我們以呼吸道上皮細胞A549和BEAS-2B細胞作為RSV的感染模型，以胞漿 lnc-NRAV及其調控的下游 miRN

6、A、靶基因為研究對象，深入探討了lnc-NRAV對RSV感染的影響，進一步豐富了對lncRNAs與呼吸道感染病毒相互關系的了解。
　　第一部分：RSV感染對呼吸道上皮細胞 lnc-NRAV表達的影響及l(fā)nc-NRAV對病毒增殖的調節(jié)作用
　　目的：
　　通過qRT-PCR驗證RSV感染細胞長鏈非編碼RNA NEAT1、PRINS、NEST和NRAV的表達情況；利用生物信息學手段，了解長鏈RNA NRAV的蛋白質編碼能力

7、和序列保守性；通過qRT-PCR，探討RSV感染對A549和BEAS-2B細胞lnc-NRAV表達的影響；通過敲低或過表達細胞中l(wèi)nc-NRAV的表達量，探討lnc-NRAV對病毒增殖可能的影響。
　　方法：
　　1.RSV（MOI=3）感染A549細胞后12h、24h、36h，qRT-PCR檢測長鏈非編碼RNA NEAT1、PRINS、NEST和NRAV的表達情況。
　　2.根據(jù)上一步的檢測結果，只有長鏈RNA NR

8、AV在RSV感染的A549細胞中有表達變化。故使用 LNCipedia、UCSC數(shù)據(jù)庫分析長鏈RNA NRAV的蛋白質編碼能力、二級結構和序列保守性。
　　3.以感染復數(shù)MOI=3的RSV病毒感染A549或BEAS-2B細胞28h，每2h收取一次細胞總RNA，qRT-PCR檢測lnc-NRAV表達量。
　　4.在過表達 lnc-NRAV的細胞中感染 RSV，感染后第4～28h每4h收取一次細胞總RNA，qRT-PCR檢測RS

9、V NS1、N、F、G、M、M2基因的相對表達量；在感染后第24h、48h、72h收取細胞總蛋白，Western blot檢測RSVF蛋白的表達量；在感染后第24～48h每4h收取一次細胞上清，病毒空斑試驗檢測細胞上清中RSV病毒滴度的變化情況。
　　5.在敲低lnc-NRAV的細胞中感染RSV,在感染后第4～28h每4h收取細胞總RNA，qRT-PCR檢測RSV相關基因的相對表達量；在感染后第24h、48h、72h收取細胞總蛋白

10、，Western blot檢測RSV F蛋白的表達量；在感染后第24h～48h每4h收取一次細胞上清，病毒空斑試驗檢測細胞上清中RSV病毒滴度的變化情況。
　　結果：
　　1.lnc-NRAV在 RSV感染 A549（MOI=3）第24h、36h表達下降（P<0.05）；lncRNA NEAT1、PRINS、NEST的表達無明顯變化（P>0.05）。
　　2.lnc-NRAV不具備編碼蛋白質的功能，具有由多個莖環(huán)結構組

11、成的二級結構，與小鼠等其他脊椎動物同源性較低。
　　3.RSV感染A54920h后，lnc-NRAV的表達量逐漸下降（P<0.05）；RSV感染BEAS-2B8h后，lnc-NRAV的表達量逐漸下降（P<0.05）。
　　4.在細胞中，上調lnc-NRAV的表達能夠促進RSV的復制。
　　在過表達lnc-NRAV的細胞中感染RSV，RSV相關基因的相對表達量明顯高于對照組（P<0.05），RSVF蛋白表達量明顯高于對照

12、組（P<0.05），細胞上清中RSV病毒滴度高于對照組（P<0.05）。
　　5.在細胞中，下調lnc-NRAV的含量能夠抑制RSV的復制。
　　在敲低lnc-NRAV的細胞中感染RSV，RSV相關基因的表達量明顯低于對照組（P<0.05）；RSVF蛋白表達量明顯低于對照組（P<0.05）；細胞上清中RSV病毒滴度低于對照組（P<0.05）。
　　第二部分：lnc-NRAV結合miR-125a/b-5p的預測及驗證

13、r>　　目的：
　　利用生物信息學手段，預測 lnc-NRAV是否具有結合 miRNA的潛力；通過雙熒光素酶報告試驗、過表達 lnc-NRAV或 lnc-NRAVmut及回復試驗，驗證在呼吸道上皮細胞中l(wèi)nc-NRAV通過不完全互補配對結合miRNA的可能性。
　　方法：
　　1.使用miRDB數(shù)據(jù)庫預測lnc-NRAV結合miRNA的潛力。
　　2.將野生型lnc-NRAV序列插入雙熒光素酶報告載體pmirGL

14、O的多克隆位點，構建雙熒光素酶報告質粒pmirGLO-NRAV。將突變型lnc-NRAV序列插入pmirGLO的多克隆位點，構建雙熒光素酶報告質粒pmirGLO-NRAVmut。在A549或BEAS-2B細胞中，將pmir-GLO、pmir-GLO-NRAV或pmir-GLO-NRAVmut與miR-125 mimics共轉染，通過雙熒光素酶報告試驗檢測lnc-NRAV通過不完全互補配對結合miRNA的可能性。
　　3.在細胞中過

15、表達或敲低miR-125a/b-5p，檢測lnc-NRAV的表達量。
　　4.構建突變型lnc-NRAV過表達質粒pcDNA3.1-NRAVmut。在A549或BEAS-2B細胞中過表達野生型或突變型lnc-NRAV，檢測細胞中游離miR-125a-5p與miR-125b-5p的含量。
　　5.在細胞中過表達lnc-NRAV、lnc-NRAVmut，或過表達lnc-NRAV的同時過表達miR-125a/b-5p，RSV感染后

16、48h收取細胞總RNA，經qRT-PCR檢測RSV相關基因的相對表達量；收取細胞總蛋白，Western blot檢測RSV F蛋白的表達量；收取細胞上清，病毒空斑試驗檢測細胞上清中RSV病毒滴度的變化情況。
　　6.在細胞中敲低lnc-NRAV，或敲低lnc-NRAV的同時敲低 miR-125a/b-5p，RSV感染后48h收取細胞總RNA，經qRT-PCR檢測RSV相關基因的相對表達量；收取細胞總蛋白，Western blot檢

17、測RSV F蛋白的表達量；收取細胞上清，病毒空斑試驗檢測細胞上清中RSV病毒滴度的變化情況。
　　結果：
　　1.在A549或BEAS-2B中，lnc-NRAV可以通過不完全互補配對結合miR-125a/b-5p。
　　2.在細胞中過表達或敲低miR-125a/b-5p，lnc-NRAV的表達量與對照組相比無明顯變化（P>0.05）。
　　3.過表達野生型lnc-NRAV，細胞中游離miR-125a-5p與miR

18、-125b-5p的含量下降（P<0.05），促進病毒復制。過表達突變型lnc-NRAV，miR-125a-5p與miR-125b-5p含量與對照組相比無明顯變化（P>0.05），對病毒復制無影響。
　　4.過表達lnc-NRAV的同時過表達miR-125a/b-5p，或者在敲低lnc-NRAV的同時敲低miR-125a/b-5p，會使呼吸道上皮細胞中RSV產量回復到對照組水平。
　　第三部分：lnc-NRAV間接調控的ceR

19、NA環(huán)路靶mRNA的預測及驗證
　　目的：
　　利用生物信息學手段，預測miR-125a/b-5p可能的靶基因，通過雙熒光素酶報告試驗驗證預測結果；在 RSV感染的呼吸道上皮細胞A549或BEAS-2B中，驗證lnc-NRAV與miR-125參與的ceRNA環(huán)路中的可能靶mRNA。
　　方法：
　　1.利用Targetscan、miRDB和microRNA三個生物信息學數(shù)據(jù)庫共同預測miR-125a-5p、miR

20、-125b-5p的靶基因，根據(jù)預測結果的交集選擇可能的靶 mRNA。根據(jù)預測結果，miR-125a/b-5p可能的靶基因有 IL-6R、IRF4、IL-31、CD5L、IL-16、CXCL13。通過qRT-PCR檢測了A549和BEAS-2B細胞中以上預測基因的表達量，因結果提示，只有IL6-R在A549和BEAS-2B細胞中有表達，故后續(xù)試驗圍繞IL-6R設計進行。
　　2.構建雙熒光素酶報告質粒pmirGLO-IL-6R。在細

21、胞中轉染pmirGLO-IL-6R的同時分別共轉染 pcDNA3.1、pcDNA3.1-NRAV或pcDNA3.1-NRAVmut，在回復試驗中共轉染 pmirGLO-IL-6R與pcDNA3.1-NRAV的同時轉染miR-125a mimics或miR-125b mimics，檢測各組熒光素酶的表達量。
　　3.在細胞中轉染pmirGLO-IL-6R的同時敲低lnc-NRAV，在回復試驗中共轉染pmirGLO-IL-6R與si-

22、NRAV的同時轉染miR-125a inhibitor或miR-125b inhibitor，檢測各組熒光素酶的表達量。
　　4.過表達lnc-NRAV、lnc-NRAVmut，或過表達lnc-NRAV的同時過表達miR-125a/b-5p，收取細胞總RNA，通過qRT-PCR檢測各組IL-6R相對表達量；收取細胞總蛋白，Western blot測各組IL-6R的表達量。
　　5.敲低lnc-NRAV或敲低lnc-NRAV的

23、同時敲低miR-125a/b-5p，收取細胞總RNA，通過qRT-PCR檢測各組IL-6R相對表達量；收取細胞總蛋白，Western blot測各組IL-6R的表達量。
　　6.過表達miR-125a/b-5p或過表達 miR-125a/b-5p的同時過表達lnc-NRAV，收取細胞總RNA，通過qRT-PCR檢測各組IL-6R相對表達量；收取細胞總蛋白，Western blot測各組IL-6R的表達量。
　　7.過表達ln

24、c-NRAV、lnc-NRAVmut、IL-6R或過表達lnc-NRAV、lnc-NRAVmut的同時敲低IL-6R的A549或BEAS-2B細胞感染RSV，感染后48h，收取細胞總RNA，經qRT-PCR檢測RSV相關基因相對表達量；收取細胞總蛋白，Western blot檢測RSV F蛋白的表達量；收取細胞上清，病毒空斑試驗檢測細胞上清中RSV病毒滴度的變化情況。
　　8.敲低lnc-NRAV、IL-6R或敲低lnc-NRAV

25、的同時過表達IL-6R的細胞感染RSV，感染后48h，收取細胞總RNA，經qRT-PCR檢測RSV相關基因相對表達量；收取細胞總蛋白，Western blot檢測RSVF蛋白的表達量；收取細胞上清，病毒空斑試驗檢測細胞上清中RSV病毒滴度的變化情況。
　　結果：
　　1.Targetscan、miRDB和microRNA三個數(shù)據(jù)庫預測，miR-125a-5p與miR-125b-5p下游靶基因中交集度及評分值較高的有IL-6R

26、、IRF4、IL-31、CD5L、IL-16、CXCL13。以qRT-PCR驗證，IL6-R Ct值為28-29，在A549和BEAS-2B細胞中有表達，其余基因Ct值>40（undetected），在細胞中未檢出。故后續(xù)試驗圍繞IL-6R設計進行。
　　2.雙熒光素酶報告試驗結果提示，在細胞中l(wèi)nc-NRAV和IL-6R均可競爭性地結合miR-125a-5p和miR-125b-5p。
　　3.lnc-NRAV和IL-6R的

27、表達量呈正相關，均起到促進RSV病毒復制的作用：
　　3.1.過表達lnc-NRAV組IL-6R的相對表達量明顯高于對照組（P<0.05），過表達 lnc-NRAVmut組IL-6R的相對表達量與對照組相比無明顯差別（P>0.05）。在回復試驗中，過表達lnc-NRAV的同時過表達miR-125a-5p或miR-125b-5p，IL-6R的相對表達量與對照組相比無明顯差別（P>0.05）。
　　3.2.敲低lnc-NRAV組

28、IL-6R的表達量明顯低于對照組（P<0.05）。在回復試驗中，同時敲低lnc-NRAV、miR-125a/b-5p，IL-6R的表達量回復至對照組水平（P>0.05）。
　　3.3.過表達miR-125a/b-5p組IL-6R的表達量明顯低于對照組（P<0.05）。在回復試驗中，同時過表達miR-125a/b-5p與lnc-NRAV，IL-6R的表達量回復至對照組水平（P>0.05）。
　　3.4.在以上過表達細胞中感染R

29、SV，結果顯示，過表達lnc-NRAV組、過表達IL-6R組RSV相關基因、F蛋白表達量及上清中病毒滴度明顯高于對照組（P<0.05），而過表達lnc-NRAVmut組則與對照組相比無明顯差別（P>0.05）；在回復試驗中，過表達 lnc-NRAV的同時敲低IL-6R，RSV以上指標與對照組相比無明顯差別（P>0.05），而過表達lnc-NRAVmut的同時敲低IL-6R，RSV的增殖明顯低于對照組（P<0.05）。
　　3.5.

30、在分別敲低lnc-NRAV、IL-6R的細胞中感染RSV，結果顯示RSV相關基因、F蛋白的表達量及上清中病毒滴度均明顯低于對照組（P<0.05）；在回復試驗中，敲低lnc-NRAV的同時過表達IL-6R，則RSV的增殖回復至對照組水平（P>0.05）。
　　結論：
　　1.RSV感染引起呼吸道上皮細胞lnc-NRAV的表達下降。
　　2.在呼吸道上皮細胞中上調lnc-NRAV能夠促進RSV在其中的復制；下調lnc-NR