長鏈非編碼RNA-LOCCS對人結腸癌干細胞增殖和分化的調控機制.pdf

1、背景：
　　課題組在前期實驗中比較了結腸癌細胞株(SW1116)和結腸癌干細胞株(SW1116csc) miRNA表達譜的差異，其中miR-93的表達具有顯著差異，miR-93能抑制SW1116csc細胞增殖和集落形成，進一步研究發(fā)現(xiàn)miR-93的過度表達抑制HDAC8和TLE4在mRNA和蛋白質水平的表達。為探索miR-93的上游調節(jié)分子及其作用機制，我們在SW1116csc細胞內篩選出一條含有miR-93互補序列的lncRNA

2、，作為下一步實驗的研究對象，并將其命名為LOCCS(lncRNA overexpressed in colon cancer stemcells)。
　　材料與方法：
　　結腸癌干細胞株(SW1116csc)是課題組前期從結腸癌細胞株(SW1116)中分離而來并進行傳代培養(yǎng)。我們首先根據(jù)LOCCS的序列設計并合成siRNA，構建和轉導pENTR/U6-siLOCCS質粒，定量PCR法檢測pENTR/U6-siLOCCS轉導S

3、W1116csc細胞后miR-93表達水平的改變;其次合成miR-93序列，構建和轉導pGL3M-miR-93熒光素酶報告載體，應用雙熒光素酶報告分析系統(tǒng)檢測內源性LOCCS分子對pGL3M-miR-93的抑制作用;然后采用全基因合成方法合成LOCCS序列，構建和轉導pcDNA-LOCCS質粒，同時使用點突變試劑盒構建pcDNA-LOCCS-T質粒后進行轉導，應用雙熒光素酶報告分析系統(tǒng)檢測外源性LOCCS分子對pGL3M-miR-93的

4、抑制作用;最后，在上調或下調LOCCS的過程中，采用定量PCR法和Western blot法檢測HDAC8、TLE4、CD133、CD29、Stratifin和Musashi-1表達水平的變化，同時檢測SW1116csc細胞生長曲線和集落形成率的改變。
　　結果：
　　pENTR/U6-siLOCCS質粒經測序鑒定能成功表達siRNA，定量PCR法檢測pENTR/U6-siLOCCS轉導后的SW1116csc細胞，其miR-

5、93表達水平明顯升高。pGL3M-miR-93質粒經測序鑒定能成功表達miR-93，應用雙熒光素酶報告分析系統(tǒng)檢測發(fā)現(xiàn)內源性LOCCS分子對pGL3M-miR-93具有明顯抑制作用。pcDNA-LOCCS質粒經測序鑒定能成功表達LOCCS并且含miR-93互補序列，同時pcDNA-LOCCS-T質粒經測序鑒定發(fā)現(xiàn)與miR-93互補序列上的堿基有明顯改變，應用雙熒光素酶報告分析系統(tǒng)檢測發(fā)現(xiàn)外源性LOCCS分子對pGL3M-miR-93具有

6、明顯抑制作用。在mRNA水平上，HDAC8和TLE4在LOCCS-ox組的表達水平較control組明顯升高，而在LOCCS-si組的表達水平較control組明顯降低;CD133、CD29、Stratifin和Musashi-1在LOCCS-ox組和LOCCS-si組的表達水平較control組明顯降低，而在LOCCS-ox組的降低更為明顯。但是，HDAC8、TLE4、CD133、CD29、Stratifin和Musashi-1在蛋白

7、質水平的表達與在mRNA水平的表達不完全一致。同時，我們觀察到細胞內的LOCCS水平與細胞增殖和集落形成率呈正相關。
　　結論：
　　實驗證實了LOCCS在SW1116csc細胞內具有“miRNA海綿”作用，能夠吸附miR-93，降低miR-93的表達水平，在miR-93的上游對其起到調控作用。LOCCS促進細胞增殖和集落形成，與miR-93的作用正好相反。LOCCS對HDAC8和TLE4的影響在mRNA水平與miR-93相