2023年全國碩士研究生考試考研英語一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁
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文檔簡介

1、背景:
  課題組在前期實驗中比較了結腸癌細胞株(SW1116)和結腸癌干細胞株(SW1116csc) miRNA表達譜的差異,其中miR-93的表達具有顯著差異,miR-93能抑制SW1116csc細胞增殖和集落形成,進一步研究發(fā)現(xiàn)miR-93的過度表達抑制HDAC8和TLE4在mRNA和蛋白質水平的表達。為探索miR-93的上游調節(jié)分子及其作用機制,我們在SW1116csc細胞內篩選出一條含有miR-93互補序列的lncRNA

2、,作為下一步實驗的研究對象,并將其命名為LOCCS(lncRNA overexpressed in colon cancer stemcells)。
  材料與方法:
  結腸癌干細胞株(SW1116csc)是課題組前期從結腸癌細胞株(SW1116)中分離而來并進行傳代培養(yǎng)。我們首先根據(jù)LOCCS的序列設計并合成siRNA,構建和轉導pENTR/U6-siLOCCS質粒,定量PCR法檢測pENTR/U6-siLOCCS轉導S

3、W1116csc細胞后miR-93表達水平的改變;其次合成miR-93序列,構建和轉導pGL3M-miR-93熒光素酶報告載體,應用雙熒光素酶報告分析系統(tǒng)檢測內源性LOCCS分子對pGL3M-miR-93的抑制作用;然后采用全基因合成方法合成LOCCS序列,構建和轉導pcDNA-LOCCS質粒,同時使用點突變試劑盒構建pcDNA-LOCCS-T質粒后進行轉導,應用雙熒光素酶報告分析系統(tǒng)檢測外源性LOCCS分子對pGL3M-miR-93的

4、抑制作用;最后,在上調或下調LOCCS的過程中,采用定量PCR法和Western blot法檢測HDAC8、TLE4、CD133、CD29、Stratifin和Musashi-1表達水平的變化,同時檢測SW1116csc細胞生長曲線和集落形成率的改變。
  結果:
  pENTR/U6-siLOCCS質粒經測序鑒定能成功表達siRNA,定量PCR法檢測pENTR/U6-siLOCCS轉導后的SW1116csc細胞,其miR-

5、93表達水平明顯升高。pGL3M-miR-93質粒經測序鑒定能成功表達miR-93,應用雙熒光素酶報告分析系統(tǒng)檢測發(fā)現(xiàn)內源性LOCCS分子對pGL3M-miR-93具有明顯抑制作用。pcDNA-LOCCS質粒經測序鑒定能成功表達LOCCS并且含miR-93互補序列,同時pcDNA-LOCCS-T質粒經測序鑒定發(fā)現(xiàn)與miR-93互補序列上的堿基有明顯改變,應用雙熒光素酶報告分析系統(tǒng)檢測發(fā)現(xiàn)外源性LOCCS分子對pGL3M-miR-93具有

6、明顯抑制作用。在mRNA水平上,HDAC8和TLE4在LOCCS-ox組的表達水平較control組明顯升高,而在LOCCS-si組的表達水平較control組明顯降低;CD133、CD29、Stratifin和Musashi-1在LOCCS-ox組和LOCCS-si組的表達水平較control組明顯降低,而在LOCCS-ox組的降低更為明顯。但是,HDAC8、TLE4、CD133、CD29、Stratifin和Musashi-1在蛋白

7、質水平的表達與在mRNA水平的表達不完全一致。同時,我們觀察到細胞內的LOCCS水平與細胞增殖和集落形成率呈正相關。
  結論:
  實驗證實了LOCCS在SW1116csc細胞內具有“miRNA海綿”作用,能夠吸附miR-93,降低miR-93的表達水平,在miR-93的上游對其起到調控作用。LOCCS促進細胞增殖和集落形成,與miR-93的作用正好相反。LOCCS對HDAC8和TLE4的影響在mRNA水平與miR-93相

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