長鏈非編碼RNA ROR對胃癌干細胞增殖和侵襲能力以及特性的功能研究.pdf

1、第一部分胃癌干細胞的分選與鑒定，以及細胞中l(wèi)ncRNA ROR的表達情況。
　　背景:胃癌是一種在全世界范圍內(nèi)發(fā)病率位居第四位的惡性腫瘤，在我國腫瘤發(fā)病率中，胃癌位列第二，并且腫瘤死亡率中，胃癌位列第三，給人們的健康帶來了很大威脅。胃癌具有術(shù)后轉(zhuǎn)移、容易復發(fā)、耐藥等特性，而且至今還沒有研究出其調(diào)控機制，在這幾年中，腫瘤發(fā)生發(fā)展的相關(guān)研究中，研究學者提出了腫瘤于細胞學說。該學說認為腫瘤起源于小部分具有自我更新和多種分化潛能的腫瘤細胞

2、，這部分細胞稱為腫瘤干細胞。目前，利用腫瘤干細胞表面特異的標記分子分離和純化腫瘤干細胞的方法已較為普遍，并且有研究通過利用特異性的細胞表面標志分子CD133，使用流式細胞儀從胃癌中成功分選出胃癌干細胞，并證明了CD133是胃癌干細胞的表面標志物。
　　目的:使用MKN-45細胞構(gòu)建胃癌干細胞細胞系，并檢測其中l(wèi)ncRNA ROR的功能。
　　方法:人MKN-45胃癌細胞用RMPI1640培養(yǎng)液常規(guī)培養(yǎng)，制作單細胞懸液，調(diào)整細

3、胞濃度后加入CD133-FITC抗體進行分選，孵育后使用流式細胞儀收集被CD133-FITC抗體標記的細胞，即為CD133+ MKN-45細胞（簡稱CD133+）;收集余下的未被CD133-FITC抗體標記的細胞，即為CD133-MKN-45細胞（簡稱CD133-）。并使用免疫熒光法檢測CD133+細胞中CD133與CD44v8-10的共表達定位情況;之后使用實時定量PCR法和免疫印跡法檢測CD133+和CD133-細胞中OCT4，SO

4、X2和NANOG等腫瘤干細胞標記物的表達。之后，我們使用實時定量PCR法對CD133-和CD133+細胞中l(wèi)ncRNA ROR的表達進行檢測，并取患者胃癌組織標本，分析其中l(wèi)ncRNA ROR和CD133表達量之間的關(guān)系。
　　結(jié)果:免疫熒光法檢測結(jié)果顯示，分選得到的CD133+細胞表面標記物CD133與CD44v8-10有非常好的共定位，這提示我們分選得到的細胞為胃癌腫瘤干細胞;實時定量PCR法和免疫印跡法結(jié)果則顯示，與CD13

5、3-細胞相比，CD133+細胞中腫瘤干細胞標記物OCT4，SOX2和NANOG等出現(xiàn)明顯的高表達，這進一步驗證了CD133+細胞具有腫瘤干細胞的特質(zhì)。同時，CD133+細胞中l(wèi)ncRNA ROR的表達量較CD133-顯著增多，并且患者的組織標本分析也顯示lncRNA ROR與CD133+二者表達量呈現(xiàn)顯著的正相關(guān)。
　　結(jié)論:通過流式細胞分選技術(shù)，我們使用MKN-45細胞成功構(gòu)建了胃癌腫瘤干細胞細胞系CD133+，并且測定胃癌干細

6、胞中l(wèi)ncRNA ROR表達顯著增高。
　　第二部分 lncRNA ROR對胃癌干細胞增殖、侵襲和凋亡能力的影響
　　背景:近年來，lncRNA的研究領(lǐng)域如火如茶，長度超過200個核苷酸的非編碼R NA就稱之為lncRNA。而該類lncRNA是非編碼蛋白質(zhì)，所以在原來的研究中很多人的觀點是其為轉(zhuǎn)錄噪音。不過隨著研究水平的提高，發(fā)現(xiàn)lncRNA不管是表觀遺傳、翻譯水平、轉(zhuǎn)錄水平等各個層次中都能夠?qū)虮磉_產(chǎn)生調(diào)控影響，同時在多

7、種腫瘤中都有其身影。Loewer等人員還在研究中得出lncRNA ROR與一些干細胞的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子存在著相互作用，在干細胞的重編程過程中發(fā)揮重要作用。Dewi、Lagadec等研究則發(fā)現(xiàn)與誘導干細胞相似，腫瘤干細胞參與相同的重編程過程來維持腫瘤的生長。KLF4和SOXl1這兩個基因與腫瘤干細胞的功能有關(guān)聯(lián)，并且這兩個基因與lncRNA ROR密切相關(guān)，因此lncRNA ROR可能是胃癌干細胞一個新的治療靶點。綜上所述，探究lncRNA

8、ROR在胃癌干細胞中的功能勢在必行，這為將lncRNA ROR作為治療靶點提供理論基礎(chǔ)。
　　目的:探究lncRNA ROR對胃癌干細胞增殖、侵襲和凋亡能力的影響。
　　方法:為了更好的探究lncRNA ROR在胃癌干細胞中的功能，我們將成功建立了lncRNA ROR的過表達系統(tǒng)以及敲低系統(tǒng)。我們將該過表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至CD133-細胞中，外源性過表達lncRNA ROR;同時，將能夠特異性抑制lncRNA ROR的siRNA轉(zhuǎn)

9、染至CD133+細胞中，敲低內(nèi)源性lncRNA ROR的表達。然后，在兩組中，我們使用MTT法和EdU摻入法檢測改變lncRNA ROR表達對細胞增殖能力的影響。隨后，在處理細胞24 h后，我們使用Transwell法檢測改變lncRNA ROR表達對細胞侵襲能力的影響。最后，我們利用流式細胞術(shù)使用Annexin V-FITC/PI雙染法檢測改變lncRNA ROR表達對細胞凋亡能力的影響。
　　結(jié)果:MTT法、EdU摻入法、Tr

10、answell法以及流式細胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，在CD133-細胞中過表達lncRNA ROR能夠顯著提高細胞的增殖和侵襲能力，但對細胞凋亡能力影響并不大。與此相反，在CD133+細胞中抑制內(nèi)源性lncRNA ROR則能夠明顯抑制細胞的增殖和侵襲能力，并且能夠促進細胞的凋亡能力。
　　結(jié)論:內(nèi)源性lncRNA ROR對胃癌干細胞增殖、侵襲以及抑制凋亡能力至關(guān)重要。
　　第三部分 lncRNA ROR能夠調(diào)控維持胃癌干細胞特性的轉(zhuǎn)

11、錄因子的表達
　　背景:研究結(jié)果顯示，干細胞基因的表達不正常，和惡性腫瘤發(fā)生有密切關(guān)系。而且對于胃癌的出現(xiàn)、發(fā)展、復發(fā)、轉(zhuǎn)移過程中都有關(guān)鍵性影響。干細胞轉(zhuǎn)錄因子會使得有關(guān)基因簇2(sex determining region Y-box2，SOX2)表達不正常時，致使胃粘膜上皮細胞分化失衡紊亂，引發(fā)腫瘤出現(xiàn);在細胞多能性的特點中，能夠維持該功能的標志物是八聚體結(jié)合蛋白-4（octamer binding factor4，OCT4）

12、，該蛋白能夠和細胞分化有密切關(guān)系;Nanog與體細胞實體瘤的關(guān)系也日益受到關(guān)注，NANOG具有激發(fā)腫瘤形成的干細胞樣特性。因此，本研究以胃癌干細胞為研究對象，改變內(nèi)源性lncRNA ROR表達后，探討lncRNA ROR對維持胃癌干細胞特性的重要轉(zhuǎn)錄因子的作用，為胃癌的臨床治療和預后判斷提供可能的參考依據(jù)。
　　目的:探究lncRNA ROR對胃癌干細胞特性的影響。
　　方法:我們將該過表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至CD133-細胞中，外源

13、性過表達lncRNA ROR;同時，將能夠特異性抑制lncRNA ROR的siRNA轉(zhuǎn)染至CD133+細胞中，敲低內(nèi)源性lncRNA ROR的表達。然后，在兩組中，我們使用實時定量PCR法和免疫印跡法檢測維持胃癌干細胞特性的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子OCT4、SOX2和NANOG的表達水平。
　　結(jié)果:實時定量PCR法和免疫印跡法檢測結(jié)果顯示，在CD133-細胞中過表達lncRNA ROR能夠有效的上調(diào)OCT4、SOX2和NANOG的表達水平。