信號(hào)選擇性甲狀旁腺素模擬肽影響小鼠成骨細(xì)胞的基因表達(dá)譜分析.pdf

1、背景:
　　 自從Pommer在1885年提出骨質(zhì)疏松以來(lái)，人們對(duì)骨質(zhì)疏松的認(rèn)識(shí)也隨著歷史的發(fā)展和技術(shù)的進(jìn)步而逐漸深化。早年一般認(rèn)為全身骨質(zhì)減少即為骨質(zhì)疏松，美國(guó)則認(rèn)為老年骨折為骨質(zhì)疏松。直到1990年在丹麥舉行的第三屆國(guó)際骨質(zhì)疏松研討會(huì)，以及1993年在香港舉行的第四屆國(guó)際骨質(zhì)疏松研討會(huì)上，骨質(zhì)疏松才有一個(gè)明確的定義，并得到世界的公認(rèn):原發(fā)性骨質(zhì)疏松是以骨量減少、骨的微觀結(jié)構(gòu)退化為特征的，致使骨的脆性增加以及易于發(fā)生骨折的一種

2、全身性骨胳疾病，并擬定每年的10月20日為“國(guó)際骨質(zhì)疏松日”。
　　 我國(guó)的骨質(zhì)疏松流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，40歲以上的骨質(zhì)疏松患病率為16.1％，隨年齡增加，骨質(zhì)疏松發(fā)生率遞增，60歲以上人群22.6％，超過(guò)80歲時(shí)50％人群均有患病。隨著人類(lèi)社會(huì)的發(fā)展以及醫(yī)療水平和護(hù)理水平的提高，骨質(zhì)疏松越來(lái)越成為臨床護(hù)理和治療的重點(diǎn)，同時(shí)我國(guó)也逐漸步入老齡化社會(huì)，由骨質(zhì)疏松所帶來(lái)的社會(huì)負(fù)擔(dān)也逐漸增加，骨質(zhì)疏松的機(jī)理研究和治療已經(jīng)成為一個(gè)熱點(diǎn)。<

3、br>　　 目前骨質(zhì)疏松治療的藥物主要是抗骨吸收的藥物，比如二磷酸鹽、雌激素、降鈣素denosumab（核因子KappaB配體的抗體）、odanacatib（破骨酶cathepsinK的抑制劑）、胰高血糖素樣肽2等，以放緩骨吸收為主要目的，對(duì)骨量的增加有限。骨吸收抑制藥使骨吸收量明顯減少的同時(shí)，也使骨形成量輕度減少，既出現(xiàn)骨轉(zhuǎn)化率（單位時(shí)間的骨重建量）減慢，同時(shí)呈現(xiàn)骨形成大于骨吸收，因此骨密度升高。但是抗骨吸收藥物可能產(chǎn)生一些副作用，

4、比如足量的2種骨吸收抑制藥的聯(lián)合用藥，如果雌激素足量，聯(lián)合Alendronate足量，骨形成作用降低，那么骨折愈合率降低，可能妨礙適量骨形成所保障的生理性微骨折的修復(fù)。
　　 PTH是體內(nèi)重要的骨代謝調(diào)節(jié)激素，目前唯一臨床可用的促進(jìn)骨合成代謝的藥物。天然的PTH由84個(gè)氨基酸構(gòu)成，其N(xiāo)端34個(gè)氨基酸殘基(PTH(1-34))具有同84個(gè)氨基酸相同的受體結(jié)合和受體激活功能，研究證實(shí)PTH(1-34)主要通過(guò)PKA和PKC兩種信號(hào)途

5、徑發(fā)揮作用。隨著對(duì)PTH信號(hào)通路研究的深入，發(fā)現(xiàn)PTHN端前兩位氨基酸為PTH信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的關(guān)鍵性區(qū)域，第1位絲氨酸(Ser)突變成甘氨酸(Gly)可極大削弱PTH的PLC激活作用。19位谷氨酸突變成精氨酸(Arg)可以補(bǔ)償29-34氨基酸殘基缺失引起的受體結(jié)合力的減弱。實(shí)驗(yàn)證明G1R19(1-28)和G1R19(1-34)僅具有極小的PLC激活作用，G1R19(1-28)僅僅激活cAMP/PKA信號(hào)途徑;G1R19(1-34)由于存在PT

6、H(29-34)結(jié)構(gòu)，除了激活cAMP/PKA信號(hào)途徑，還能激活PKC（non-PLC/PKC信號(hào)途徑）。三種肽可以增加小鼠遠(yuǎn)端股骨骨密度，并且PTH(1-34)和G1R19(1-34)增加股骨密度的量強(qiáng)于G1R19(1-28)。
　　 Wnt基因在胚胎發(fā)育、成人組織修復(fù)以及腫瘤的發(fā)生發(fā)面發(fā)揮著重要的作用，而近年來(lái)Wnt信號(hào)通路對(duì)骨骼系統(tǒng)，尤其是成骨細(xì)胞和軟骨細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用的研究逐漸增多。Wnt信號(hào)通路對(duì)調(diào)節(jié)骨量方面具有重要作用

7、，研究證實(shí)PTH(1-84)可以通過(guò)激活Wnt信號(hào)傳導(dǎo)通路來(lái)發(fā)揮成骨作用。那么PTH發(fā)揮成骨作用通過(guò)不同的信號(hào)途徑，這些途徑與Wnt信號(hào)通路之間存在什么樣的關(guān)系，目前還沒(méi)有見(jiàn)到相關(guān)研究的文獻(xiàn)報(bào)道。
　　 目的：
　　 1.改進(jìn)傳統(tǒng)的酶消化法，通過(guò)Ⅰ型和Ⅱ型膠原酶消化獲取成骨細(xì)胞，提供一種溫和、高效的成骨細(xì)胞原代培養(yǎng)方法。
　　 2.本研究通過(guò)表達(dá)譜基因芯片技術(shù)，篩選信號(hào)選擇性甲狀旁腺素模擬肽成骨效應(yīng)影響的差異基因

8、，并且探索PTH成骨效應(yīng)的不同信號(hào)通路與Wnt相關(guān)因子的關(guān)系，為闡明PTH成骨效應(yīng)的機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。
　　 材料與方法：
　　 1.選擇出生2d的C57BL乳鼠分離顱蓋骨，利用Ⅰ型和Ⅱ型膠原酶，37℃震蕩消化20min，棄去第一次上清，收集后四次上清液，加入10％FBS終止消化，2000rpm離心5分鐘，棄上清后，接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶和六孔板中。取接種于6孔板中的原代成骨細(xì)胞進(jìn)行鑒定:①ALP染色:培養(yǎng)14d時(shí)，取部分細(xì)胞

9、，PBS沖洗3遍，按照ALP染色試劑盒說(shuō)明行ALP染色，細(xì)胞質(zhì)染成藍(lán)色為陽(yáng)性。②茜素紅染色:取部分細(xì)胞加入成骨誘導(dǎo)液（10％FBS、50μg/mL維生素C、100mmol/Lβ-甘油磷酸鈉），28d時(shí)以PBS沖洗2遍，4％多聚甲醛固定，0.1％茜素紅37℃孵育30min，觀察紅色鈣結(jié)節(jié)的形成。
　　 2.將貼壁生長(zhǎng)的傳一代細(xì)胞，PBS沖洗三遍，1％FBS維持培養(yǎng)12h，然后隨機(jī)分成4組，分別接受10nMPTH(1-34)，10n

10、MG1R19(1-34)，100nMG1R19(1-28)和等體積的0.1％TFA作用4h，利用Trizol法提取總RNA，送公司進(jìn)行表達(dá)譜基因芯片分析，得到數(shù)據(jù)后，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行挖掘，尋找三種模擬肽引起變化的Wnt相關(guān)因子，
　　 3.實(shí)時(shí)定量PCR法檢驗(yàn)β-catenin、骨鈣素(osteocalcin，OC)，以及篩選出的Wnt信號(hào)通路相關(guān)因子的變化（此步驟重復(fù)3次）。采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差

11、表示。組間均數(shù)比較時(shí)，如果方差齊性，則采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，如果方差不齊時(shí)，采用Welch的修正值進(jìn)行方差分析，兩兩比較采用Dunnett'sT3檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)完成之后，分析這些因子與PTH通路之間的關(guān)系。
　　 結(jié)果：
　　 1.培養(yǎng)一周后倒置顯微鏡觀察，細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，呈多邊形，三角形;培養(yǎng)14d，ALP染色觀察顯示胞質(zhì)中出現(xiàn)藍(lán)染的顆粒;誘導(dǎo)培養(yǎng)28d

12、，茜素紅鈣結(jié)節(jié)染色發(fā)現(xiàn)紅色點(diǎn)狀或者片狀鈣沉積。
　　 2.通過(guò)基因芯片初步分析，得出信號(hào)選擇性甲狀旁腺素模擬肽對(duì)Wnt家族相關(guān)基因的影響:與空白對(duì)照組相比，G1R19(1-34)組Wnt2基因表達(dá)量下調(diào)2.045倍，Wnt5b基因表達(dá)量上調(diào)2.002倍，兩者均參與癌癥相關(guān)通路(Pathwaysincancer)，G1R19(1-28)組Wnt7b基因表達(dá)量下調(diào)2.438倍，參與癌癥相關(guān)通路(Pathwaysincancer)。<

13、br>　　 3.實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，OC、Wnt5b表達(dá)水平處理組均高于空白對(duì)照組;Wnt2表達(dá)水平處理組均低于空白對(duì)照組;β-catenin表達(dá)水平PTH(1-34)處理組高于空白對(duì)照組;Wnt7b表達(dá)水平PTH(1-34)，G1R19(1-34)處理組高于空白對(duì)照組，且G1R19(1-34)組高于PTH(1-34)和G1R19(1-28)處理組，以上差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，其余各因子mRNA表達(dá)兩組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)