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1、天津醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文甲狀旁腺素羧基端肽段的表達(dá)及其對大鼠成骨細(xì)胞增殖的影響姓名:李敬華申請學(xué)位級別:碩士專業(yè):生物化學(xué)與分子生物學(xué)指導(dǎo)教師:郭剛20100501天津醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文進(jìn)行濃度為15%的SDSPAGE,觀察多肽表達(dá)情況;表達(dá)產(chǎn)物電泳凝膠對硝酸纖維素濾膜恒壓轉(zhuǎn)膜,山羊抗人PTH羧基端多克隆抗體進(jìn)行WesternBlot鑒定,Xray曝光觀察顯影情況。5表達(dá)多肽的分離純化與濃度測定大量表達(dá)產(chǎn)物的碎菌上清進(jìn)行Ni2_IDA
2、金屬螯合親和層析,收集洗脫液,BCA法測定純化后總蛋白濃度,采用ChemiGenius凝膠成像分析系統(tǒng)分析目的多肽的純度,計(jì)算多肽濃度。6PTH各種多肽片段對大鼠成骨細(xì)胞增殖的影響復(fù)蘇凍存的大鼠成骨細(xì)胞,傳代并接種于96孔板,待培養(yǎng)至細(xì)胞處于亞融合狀態(tài)后分別加入不同濃度rhPTHl臥rhPTHl34、rhPTH784及rhPTH3784。作用24小時(shí),MTT法檢測570nm吸光度值,觀察細(xì)胞增殖情況。結(jié)果1PCR擴(kuò)增結(jié)果PCR產(chǎn)物經(jīng)15
3、%瓊脂糖凝膠電泳,獲得了約270bp、250bp及160bp的清晰條帶,與預(yù)期一致。2重組表達(dá)質(zhì)粒的PCR及酶切鑒定重組表達(dá)質(zhì)粒pQE一30XafPTHl84、pQE一30Xa/PTH784及pQE30XaJPTH3784經(jīng)PCR初步鑒定,瓊脂糖凝膠可見相應(yīng)大dxDNA片段;經(jīng)Sall和腳玎dIII雙酶切,得到約3500bp的pQE30Xa線性片段和約270bp、250bp及160bp含目的基因的重組片段;酶切陽性質(zhì)粒DNA測序分析與預(yù)
4、期完全一致。3表達(dá)產(chǎn)物的SDS—PAGE及WesternBlot鑒定誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行SDSPAGE鑒定,考馬斯亮藍(lán)R250染色可見碎菌上清液中存在分子量與預(yù)期大小相符的蛋白條帶;以抗人PTH羧基端多克隆抗體進(jìn)行鑒定,顯示有明顯的蛋白質(zhì)印跡帶,證實(shí)條帶為含有PTH羧基端肽段的多肽。4表達(dá)產(chǎn)物BCA濃度測定及純度鑒定IPTG優(yōu)化誘導(dǎo)表達(dá)后,產(chǎn)物經(jīng)鎳離子親和層析法純化,BCA法蛋白濃度測定及凝膠成像分析后計(jì)算rhPTHl84、rhPTH784
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