降鈣素基因相關肽對氧化損傷的小鼠成骨細胞的保護作用研究.pdf

1、機體在正常代謝中的不同階段均會產生或多或少的活性氧(Reactive oxygen species，ROS);當機體遭受創(chuàng)傷時，自身抗氧化能力下降、ROS產生增多，同時機體自身防御機制啟動，產生大量的IL-6、IL-1β、TNF-α等炎癥因子，當ROS和各種炎癥因子同時作用于成骨細胞時，成骨細胞的增殖、分化水平降低，骨創(chuàng)傷愈合減緩，甚至停滯。骨創(chuàng)傷愈合是一個復雜的連續(xù)的病理生理過程，包括多種分子信號、細胞因子的參與。
　　有實驗證

2、實，神經系統(tǒng)參與骨重塑。在機體骨折或者其他外傷時，外周肽能神經可以通過一些神經肽影響破骨細胞的形成，進而影響骨折或者其他外傷的愈合。降鈣素基因相關肽（Calcitonin gene-related peptide，CGRP）是一種由特定神經元的可變剪接生成的37個氨基酸組成，是骨修復和發(fā)育過程中神經纖維所表達的一種重要的神經肽。
　　目的:
　　本課題組前期研究發(fā)現，CGRP在骨創(chuàng)傷愈合的過程中，部分通過促進成骨細胞增殖分化

3、來發(fā)揮其促進修復作用，本實驗將進一步證實是否有部分是通過保護成骨細胞氧化損傷來實現其促進修復作用。
　　本實驗擬構建小鼠成骨細胞的氧化損傷模型，通過對ROS的含量、超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)活性以及炎癥因子白細胞介素(Interleukin，IL)-6、IL-1β、腫瘤壞死因子(Tumor necrosis factor，TNF)-α水平的檢測，來探索CGRP對小鼠成骨細胞的抗氧化損傷保護作

4、用及其相關機制。
　　方法:
　　1.體外分離、培養(yǎng)、鑒定原代Balb/c小鼠成骨細胞。
　　2.在體外用過氧化氫(H2O2)構建小鼠成骨細胞氧化損傷模型。
　　3.使用不同濃度的CGRP（10-6、10-7、10-8、10-9、10-10mo l/L）預處理在體外培養(yǎng)的小鼠成骨細胞1h后，CCK(Cell counting kit)-8法檢測各組細胞活性并篩選優(yōu)勢濃度。
　　4.使用SOD試劑盒對H2O2

5、和CGRP處理后的小鼠成骨細胞進行SOD活性檢測。
　　5.使用ROS試劑盒對H2O2和CGRP處理后的小鼠成骨細胞進行ROS含量檢測。
　　6.使用小鼠IL-6、IL-1β、TNF-α定量分析酶聯免疫吸附測定(Enzyme-linked immuno sorbent assay，ELISA)試劑盒檢測H2O2和CGRP處理后的小鼠成骨細胞。
　　結果:
　　1.成功分離并純化擴增Balb/c小鼠成骨細胞。

6、>　　2.在體外小鼠成骨細胞培養(yǎng)基中加入H2O2，成功構建小鼠成骨細胞氧化損傷模型。使用CCK-8法檢測細胞活性，小鼠成骨細胞在含不同濃度(10-1、10-2、10-3、10-4、10-5mol/L)H2O2的培養(yǎng)液的條件下培養(yǎng)12、24、36、48h后，當培養(yǎng)液使用的是含10-4mol/L的H2O2培養(yǎng)液培養(yǎng)時，細胞的增殖活性開始受到抑制(P＜0.01)。
　　3.CCK-8法結果顯示，小鼠成骨細胞在含不同濃度(10-6、10-

7、7、10-8、10-9、10-10mol/L)CGRP的培養(yǎng)液的條件下預處理1h后，當使用的培養(yǎng)液是含10-8mol/L的CGRP培養(yǎng)液培養(yǎng)時，細胞的增殖活性最高(P＜0.01)。
　　4.SOD試劑盒檢測結果提示，CGRP組SOD活性與空白對照組相比，明顯升高(P＜0.05);H2O2組SOD活性較空白對照組相比受到明顯抑制(P＜0.05);CGRP+H2O2組SOD活性相對于H2O2組是顯著升高的(P＜0.01)。
　　

8、5.ROS試劑盒檢測結果提示，H2O2處理后，ROS含量相對于對照組顯著增高(P＜0.01);先使用10-8mol/L CGRP預處理后再用H2O2處理，其ROS含量與單獨使用H2O2處理相比顯著降低(P＜0.01)。
　　6.小鼠IL-6、IL-1β、TNF-αELISA試劑盒結果提示，使用10-4mol/L H2O2的培養(yǎng)液處理后，小鼠成骨細胞IL-6、IL-1β、TNF-α分泌與空白對照組相比，明顯增高(P＜0.01);而預

9、處理使用含10-8mol/L CGRP的培養(yǎng)液后接著再使用H2O2處理，IL-6、IL-1β、TNF-α分泌水平相對于H2O2組明顯降低(P＜0.05)。
　　結論:
　　1.使用貼壁篩選手段可以成功的從Balb/c小鼠顱骨獲取所需要的成骨細胞
　　2.H2O2能夠成功構建小鼠成骨細胞氧化損傷模型，H2O2對小鼠成骨細胞會造成氧化損傷
　　3.CGRP對小鼠成骨細胞具有促進增殖，保護氧化損傷作用，其優(yōu)勢濃度為10