脫氧雪腐鐮刀菌烯醇對小鼠成骨細(xì)胞PAX1基因表達(dá)的影響.pdf

1、目的：利用小鼠成骨細(xì)胞(mouseosteoblast)為體外試驗?zāi)Ｐ?，探討脫氧雪腐鐮刀菌烯?deoxynivalenol，DON)對小鼠成骨細(xì)胞增殖和凋亡的影響；及其對成骨細(xì)胞Pax1基因表達(dá)的影響，進(jìn)而揭示DON干擾成骨細(xì)胞生長和分化的分子機制，為防治DON所致的骨骼畸形奠定理論基礎(chǔ)。
　　 方法：體外培養(yǎng)小鼠成骨細(xì)胞，將不同濃度的DON分別作用于對數(shù)生長期的成骨細(xì)胞，噻唑藍(lán)(MTT)比色法檢測DON對成骨細(xì)胞增殖的影響；

2、流式細(xì)胞儀和熒光染色檢測DON誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，Western blot檢測凋亡蛋白Bax、Bc1-2表達(dá)量變化；Trizol法裂解細(xì)胞，提取成骨細(xì)胞總RNA，普通半定量PCR和熒光定量PCR法檢測DON對Pax1基因轉(zhuǎn)錄水平的影響；用RIPA細(xì)胞裂解液提取成骨細(xì)胞總蛋白，通過Westernblot檢測DON對Pax1蛋白表達(dá)水平的影響。
　　 結(jié)果：⑴將含有不同濃度DON的培養(yǎng)液作用于對數(shù)生長期的成骨細(xì)胞，觀察DON對成骨細(xì)胞增

3、殖的影響。隨DON濃度的增加，作用時間的延長，吸光度值呈逐漸降低的趨勢。當(dāng)DON濃度為100ng/ml、200ng/ml時，吸光度值變化不明顯。當(dāng)DON濃度為500ng/ml、1000ng/ml、1500ng/ml時，表現(xiàn)為明顯的細(xì)胞毒性作用，吸光度值明顯降低，與空白對照組兩兩比較有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。且同一濃度的DON作用組，培養(yǎng)時間越長，吸光度值越低。從細(xì)胞增殖抑制率折線狀圖可見：隨DON濃度的增加和作用時間的延長，細(xì)胞的數(shù)

4、量逐漸減少，表明DON可明顯抑制成骨細(xì)胞的增殖。顯微鏡下觀察500ng/ml、1000ng/ml、1500ng/ml組細(xì)胞數(shù)量明顯減少，細(xì)胞周圍的突起減少甚至消失，可見細(xì)胞碎片、核碎裂等細(xì)胞凋亡表現(xiàn)。⑵流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示：將含有不同濃度DON的培養(yǎng)液作用于對數(shù)生長期的成骨細(xì)胞，隨DON濃度的增加，細(xì)胞增殖指數(shù)降低。與對照組相比，有顯著性差異。凋亡率隨DON濃度的增加而升高，呈現(xiàn)劑量依賴關(guān)系。AO-EB熒光染色觀察結(jié)果顯示：對照組細(xì)胞

5、核呈均染綠色熒光，形態(tài)結(jié)構(gòu)正常。DON500、1000ng/ml作用48h，大部分細(xì)胞胞核染色增強，熒光更為明亮，但細(xì)胞核開始固縮或呈串珠狀，表現(xiàn)為早期凋亡細(xì)胞核，也有部分細(xì)胞核染色質(zhì)呈橘紅色熒光，且胞核出現(xiàn)碎片，表現(xiàn)為晚期凋亡細(xì)胞核。1500ng/mlDON作用成骨細(xì)胞48h后，細(xì)胞數(shù)目明顯減少，細(xì)胞大部分表現(xiàn)為晚期凋亡。Western blot檢測顯示：500、1000、1500ng/mlDON作用組，Bc1-2蛋白表達(dá)減少，Bax

6、蛋白表達(dá)增加，Bax/Bc1-2比值增大。以上試驗表明DON具有明顯的誘導(dǎo)成骨細(xì)胞凋亡的作用。⑶RT-PCR凝膠電泳圖顯示：DON可明顯增加成骨細(xì)胞中Pax1基因的mRNA表達(dá)水平。且隨DON濃度增加，Pax1基因表達(dá)量逐漸升高，Pax1條帶的亮度逐漸增強。1500ng/ml組與1000ng/ml組相比，Pax1基因表達(dá)量稍下降。DON500ng/ml、1000ng/ml、1500ng/ml組與空白對照組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.

7、05)。實時熒光定量PCR結(jié)果顯示：DON可明顯增加成骨細(xì)胞中Pax1基因的相對表達(dá)量。且隨DON濃度增加，Pax1基因表達(dá)量逐漸升高。500ng/ml、1000ng/ml、1500ng/ml組與空白對照組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。Western blot檢測顯示：DON可明顯增加成骨細(xì)胞中Pax1基因的蛋白表達(dá)水平。且隨DON濃度增加，Pax1蛋白條帶的灰度值逐漸增強。DON500ng/ml、1000ng/ml、1500