RNA干擾及厄洛替尼阻斷EGFR信號(hào)途徑對(duì)肺腺癌A549抗增殖作用及其機(jī)制研究.pdf

1、目的:研究RNA干擾及厄洛替尼兩種途徑阻斷表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)信號(hào)對(duì)肺腺癌A549細(xì)胞株形態(tài)學(xué)的影響，EGFRmRNA表達(dá)、凋亡率及EGFR及Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)的變化，從而為肺癌的分子靶向治療提供新思維。
　　 方法:人肺腺癌A549細(xì)胞株以含10％胎牛血清的PRMI1640完全培養(yǎng)基培養(yǎng)于37℃、5％CO2飽和濕度的恒溫箱內(nèi)。實(shí)驗(yàn)分正常對(duì)照組、厄洛替尼組、RNA干擾組。EGFR基因中的序列以及siRNA設(shè)計(jì)原則

2、設(shè)計(jì)合成設(shè)計(jì)相應(yīng)的siRNA，并轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞48h后提取總RNA，采用RT-PCR技術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)染后A549細(xì)胞株中EGFRmRNA的變化。取適量DMSO液容解厄洛替尼母液，均于實(shí)驗(yàn)前以PRMI1640培養(yǎng)基稀釋至50μmol/L，藥物干預(yù)48h。倒置舊差顯微鏡下觀察各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率，Westernblot檢測(cè)EGFR、Bcl-2、Bax蛋白的變化。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以X±s表示，用SPSS12.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分

3、析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果:
　　 1、倒置相差顯微鏡下細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化
　　 A.空白對(duì)照組:細(xì)胞生長(zhǎng)良好，緊貼瓶壁排列，可見(jiàn)細(xì)胞核分裂相。
　　 B.厄洛替尼組:細(xì)咆間隙增寬，正常細(xì)胞形態(tài)消失，細(xì)胞貼壁疏松，仍見(jiàn)多量貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞。
　　 C.RNA干擾組:細(xì)胞生長(zhǎng)抑制更為顯著，細(xì)胞形態(tài)不能辨認(rèn)，細(xì)胞皺縮脫落呈透亮空泡，無(wú)貼壁生長(zhǎng)細(xì)胞。
　　 2.、RT-PCR檢測(cè)

4、EGFRmRNA/GAPDH相對(duì)光密度比值影響。
　　 空白對(duì)照組、陰性RNA對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組、脂質(zhì)體2000對(duì)照組EGFRmRNA/GAPDH相對(duì)光密度值分別為0.76、0.72、0.31、0.70，陰性RNA對(duì)照組及脂質(zhì)體2000對(duì)照組與與空白對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)(P＞0.05)學(xué)意義，而實(shí)驗(yàn)組光密度值較空白對(duì)照組差異顯著(P＜0.05)，證實(shí)RNA干擾可抑制EGFR基因表達(dá)。
　　 3、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡的變化.

5、r>　　 流式細(xì)胞術(shù)分析顯示:對(duì)照組、厄洛替尼組、RNA干擾組肺腺癌A549細(xì)胞的凋亡率分別為23.5％、57.4％、83.2％，阻斷EGFR信號(hào)途徑可促進(jìn)A549細(xì)胞凋亡，其差異較對(duì)照組有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義((P＜0.05)。
　　 4、Westernblot檢測(cè)EGFR、Bcl-2、Bax相對(duì)蛋白量表達(dá)的影響
　　 Westernblot分析顯示與對(duì)照組相比，厄洛替尼組及RNA干擾組EGFR表達(dá)降低，Bcl-2水平表達(dá)降低