厄羅替尼聯(lián)合塞來昔布阻斷EGFR和COX-2信號途徑抑制肺癌A549細胞增殖.pdf

1、目的:國內外研究報道非小細胞肺癌組織(NSCLC)常有EGFR和COX-2高表達,并常與肺癌發(fā)生、發(fā)展、侵襲和轉移等生物特性有密切關系。本研究探討表皮生長因子受體(EGFR)抑制劑厄羅替尼(Erlotinib)聯(lián)合環(huán)氧合酶-2(COX-2)抑制劑塞來昔布(Celecoxib)聯(lián)合干預肺腺癌A549細胞后是否具有協(xié)同殺傷作用,并對其機制進行初步研究,從而為非小細胞肺癌治療提供新的思路。
　　 方法:厄羅替尼、塞來昔布單獨或聯(lián)合干預

2、細胞48h后,倒置相差顯微鏡觀察細胞形態(tài);四甲基偶氮唑鹽(MTT)測定細胞抑制率;Hoechst33258法、TUNEL和AnnexinV/PI法檢測細胞凋亡和流式細胞術檢測細胞周期;免疫熒光檢測EGFR和COX-2蛋白表達。實驗數據以-x±s表示,用SPSS11.5軟件進行t檢驗、X2檢驗和方差分析,P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
　　 結果:
　　 1、倒置相差顯微鏡下形態(tài)學觀察
　　 ①未加藥的正常A54

3、9設為空白對照組:細胞形態(tài)正常,細胞緊密貼壁,邊界清楚透明度高,生長旺盛,可見各期核分裂相。
　　 ②50μmol/L厄羅替尼單藥組:細胞體積明顯縮小,細胞間隙增大,細胞貼壁減慢,胞內出現顆粒,可見細胞碎片。
　　 ③25μmol/L塞來昔布單藥組:細胞略變圓縮小,空泡和顆粒增多,形態(tài)改變,細胞間隙增大?？梢娚倭康牡蛲鲂◇w。
　　 ④50μmol/L厄羅替尼+25μmol/L塞來昔布聯(lián)合用藥組:相比單藥組細胞明顯

4、皺縮變圓脫落,顆粒增多開始碎解,見細胞碎片和凋亡小體。
　　 2、四甲基偶氮唑鹽(MTT法)檢測藥物對細胞生長的抑制作用:厄羅替尼和塞來昔布單獨或聯(lián)合應用后,應用MTT檢測生長抑制率提示兩者分別對A549細胞的殺傷效應呈劑量依賴性和時間依賴性。單藥厄羅替尼(50μmol/L)、塞來昔布(25μmol/L)作用48小時的細胞抑制率依次為(34.35±2.77)％、(26.66±2.12)％,厄羅替尼(50μmol/L)聯(lián)合塞來昔布

5、(25μmol/L)組抑制率為(50.33±3.27)％明顯高于單藥組。
　　 3、藥物聯(lián)合治療后的凋亡效應:Hoechst33258染色法結果顯示:空白對照組核形態(tài)均勻,未見邊聚現象,胞內染色均一,形狀規(guī)則,細胞聯(lián)系緊密。而藥物處理組均見細胞縮小,形態(tài)異常,胞質染色較深,熒光增強、染色質濃縮、碎片,可見凋亡小體形成。對照組的凋亡率為(0.78±0.04)％;而聯(lián)合用藥組凋亡率為(63.37±2.12)％,顯著高于單用厄羅替尼組

6、的(32.56±1.67)％和塞來昔布組的(25.67±1.98)％。
　　 TUNEL染色法:凋亡陽性細胞的判斷:凋亡細胞表現為細胞胞核呈棕黃色著色,細胞漿不著色。實驗中加藥組均可見凋亡陽性細胞,聯(lián)合加藥組凋亡現象顯著。對照組的(0.95±0.24)％,聯(lián)合用藥組細胞凋亡率為(42.13±1.4)％顯著高于單用厄羅替尼組的(32.56±1.67)％和塞來昔布組的(25.67±1.98)％。
　　 Annexin V/P

7、I法結果顯示:正常對照組早期凋亡率為(0.86±1.3)％,50μmol/L厄洛替尼聯(lián)合25μmol/塞來昔布處理A549細胞48h后,可見(52.47±2.3)％的細胞凋亡,明顯高于50μmol/L厄洛替尼、25μmol/塞來昔布單獨用藥的細胞凋亡率分別為(30.24±1.7％)、(22.13±1.2)％。
　　 4、藥物對細胞周期的影響:厄羅替尼、塞來昔布均可以阻滯細胞周期,引起G1期細胞比例明顯增加,S期細胞比例明顯減少。

8、與單藥組相比,聯(lián)合用藥組G0～G1期阻滯作用明顯。
　　 5、免疫熒光法檢測藥物對細胞EGFR和COX-2蛋白的影響:A549細胞中EGFR和COX-2均有表達?？瞻讓φ战MEGFR和COX-2熒光很強,可見兩者在A549細胞中均高表達。厄羅替尼及塞來昔布單藥組EGFR和COX-2表達均減弱,而聯(lián)合用藥后EGFR和COX-2表達均顯著減弱,具有統(tǒng)計學意義。
　　 結論:厄羅替尼與塞來昔布聯(lián)合應用具有協(xié)同抑制細胞生長,介導細