干細胞移植誘導(dǎo)產(chǎn)生調(diào)節(jié)性T細胞在同種異體心臟移植中的作用.pdf

1、第一部分:大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞納米鐵顆粒標記
　　目的:以超順磁氧化鐵納米顆粒標記大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞，檢測納米鐵標記對骨髓間充質(zhì)干細胞功能的影響。
　　方法:取200-250gWistar大鼠，分離股骨和脛骨的骨髓后，以貼壁分離法獲取大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞，并傳代培養(yǎng)，顯微鏡下觀察生長。取第三代骨髓間充質(zhì)干細胞，以流式細胞儀分別檢測細胞表面CD14、CD29、CD31、CD34、CD45、CD90分子表達情況。以超順磁氧化鐵

2、納米顆粒溶液(SPIO25ug/ml，PLL0.75ug/ml)標記間充質(zhì)干細胞，光鏡下觀察細胞生長情況，透射電鏡觀察細胞標記狀況。并將鈉米鐵顆粒標記前后的間充質(zhì)干細胞分別進行成骨和成脂肪誘導(dǎo)分化，觀察納米鐵標記對干細胞分化功能的影響情況。
　　結(jié)果:貼壁分離培養(yǎng)法可以順利分離并純化大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞，細胞生長良好，表面分子CD29、CD90呈陽性表達，不表達CD14、CD31、CD34、CD45，符合骨髓間充質(zhì)干細胞特征。納米

3、鐵標記后細胞生長良好，電鏡下見細胞形態(tài)無變化，胞漿內(nèi)可見SPIO顆粒。標記前后間充質(zhì)干細胞均具有良好成骨和成脂肪分化功能。
　　結(jié)論:含25ug/mlSPIO，0.75/mlPLL的超順磁氧化鐵標記溶液可良好標記大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞，對干細胞表面分子表達及成骨、成脂肪等基本生物學(xué)功能無明顯影響。
　　第二部分:大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞對T細胞功能影響的體外實驗研究
　　第一節(jié)骨髓間充質(zhì)干細胞對T淋巴細胞增殖能力影響研究

4、r>　　目的:通過體外混合淋巴細胞反應(yīng)，檢測大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞對T淋巴細胞增殖能力的影響。
　　方法:以SD大鼠T淋巴細胞5×104個為反應(yīng)細胞，Wistar大鼠T淋巴細胞5×104個為刺激細胞，建立單向混合淋巴細胞反應(yīng)，反應(yīng)中另分別加入不同量Wistar大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞。分組:A組:SD大鼠T淋巴細胞單獨培養(yǎng);B組:SD大鼠T淋巴細胞+Wistar大鼠T淋巴細胞;C組:SD大鼠T淋巴細胞+Wistar大鼠T淋巴細胞+Wis

5、tar大鼠MSC細胞5×102個;D組:SD大鼠T淋巴細胞+Wistar大鼠T淋巴細胞+Wistar大鼠MSC細胞5×103個;E組:SD大鼠T淋巴細胞+Wistar大鼠T淋巴細胞+Wistar大鼠MSC細胞5×104個?；旌霞毎磻?yīng)72h后，H3摻入法檢測各組細胞增殖情況，
　　結(jié)果:混合淋巴細胞反應(yīng)后，B、C、D、E各實驗組T細胞明顯增殖，與A組有顯著統(tǒng)計學(xué)差異，加入干細胞的C、D、E各組T細胞增殖能力逐漸下降，組間有顯著差異

6、。
　　結(jié)論:大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞在體外可以抑制反應(yīng)性T淋巴細胞的增殖，這種抑制作用具有干細胞數(shù)量依賴性。
　　第二節(jié)骨髓間充質(zhì)干細胞對T淋巴細胞亞群的影響研究
　　目的:通過體外混合細胞培養(yǎng)，檢測大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞對T淋巴細胞亞群的影響。
　　方法:同第一節(jié)分組方法建立體外混合細胞培養(yǎng)體系，細胞培養(yǎng)72h后，流式細胞儀檢測各組CD4+CD25+T細胞比例，并計算各組CD4+/CD8+T細胞比值。ELISA法檢

7、測各組培養(yǎng)上清液中IL-2，IL-4，IL-10，TGF-β1，IFN-γ水平。
　　結(jié)果:混合細胞反應(yīng)后，加入干細胞的C、D、E各組，CD4+CD25+T細胞比例及CD4+/CD8+T細胞比值逐漸增加，C、D、E各組有統(tǒng)計學(xué)差異。B、C、D、E各組IL-2和IFN-γ水平逐漸下降，IL-4、IL-10、TGF-β1水平逐漸升高，各組間有統(tǒng)計學(xué)差異。
　　結(jié)論:大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞在體外淋巴細胞混合培養(yǎng)中，可以提高CD4+C

8、D25+調(diào)節(jié)性T細胞比例，及CD4+/CD8+細胞比值，這種作用具有劑量依賴性，與提高TGF-β1、IL-4、IL-10水平，降低IL-2、IFN-γ水平，促進Th細胞分化向Th2方向偏移等因素有關(guān)。
　　第三部分骨髓間充質(zhì)干細胞靜脈輸注聯(lián)合胸腺注射誘導(dǎo)同種移植免疫耐受的實驗研究
　　目的:研究大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞移植預(yù)處理方法誘導(dǎo)大鼠同種異體心臟移植免疫耐受的作用，并探討分子機制。
　　方法:建立雄性Wistar大鼠

9、至雌性SD大鼠同種異體腹腔異位心臟移植模型。在心臟移植前1周，分別取納米鐵標記的供體Wistar大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞，進行受體SD大鼠的胸腺內(nèi)注射和尾靜脈注射。實驗分組:A組（對照組）:僅行Wistar大鼠至SD大鼠腹腔同種異位心臟移植;B組（靜脈注射組）:受體（SD大鼠）經(jīng)頸靜脈注射供體（Wistar大鼠）MSCs1×106/0.2ml，一周后行Wistar大鼠至SD大鼠腹腔同種異位心臟移植;C組（胸腺注射組）:受體（SD大鼠）胸腺內(nèi)

10、注射供體（Wistar大鼠）MSCs5×105/0.1ml，余同B組;D組（靜脈注射+胸腺注射組）:受體（SD大鼠）經(jīng)頸靜脈注射供體（Wistar大鼠）MSCs1×106/0.2ml，余同C組。觸診法觀察心臟移植物存活時間。移植后第1、3、5天分別取心臟移植物分離淋巴細胞，提取RNA，相對定量RT-PCR檢測各組IL-2、IL-4、IL-10、IFN-γ、miR-7a、miR-155、miR-182、miR-183、miR-434-3p

11、水平。分別取外周血，以流式細胞儀檢測CD4+CD25+Foxp3+T淋巴細胞比例。PCR檢測受體內(nèi)供體SRY基因表達情況。MRI和普魯士藍染色檢測標記干細胞在移植后的分布狀況。
　　結(jié)果:大鼠同種異體心臟移植后，B、C、D組移植物存活時間較對照組明顯延長，有統(tǒng)計學(xué)差異。CD4+CD25+Foxp3+T淋巴細胞比例逐步提高，第5天明顯，有統(tǒng)計學(xué)差異。移植后第1、3、5天miR-7a、miR-182、miR-183水平逐步升高，miR

12、-434-3p水平逐步降低，各時間點有統(tǒng)計學(xué)差異，但同一時間點各組差異不明顯。第3天和第5天B、C、D組miR-155水平增幅下降，與對照組相比有統(tǒng)計學(xué)差異，D組有顯著差異。移植后第5天，IL-2、IFN-γ水平明顯下降，與對照組相比，B組有統(tǒng)計學(xué)差異，C、D組有顯著差異;C、D組IL-4水平升高，有統(tǒng)計學(xué)差異;D組IL-10水平升高，有顯著性差異。B、C組受體大鼠腹腔淋巴結(jié)均可見供體SRY基因表達。MRI和普魯士藍染色可見胸腺及移植心

13、臟內(nèi)標記干細胞存留，數(shù)量逐漸減少。
　　結(jié)論:大鼠同種心臟移植后，受體miR-155，miR-182，miR-183和miR-7表達升高，miR-434-3p表達下降。胸腺內(nèi)注射供體MSCs和靜脈內(nèi)注射供體MSCs可以增加受體內(nèi)CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞數(shù)量，降低受體大鼠miR-155表達水平，提高移植物細胞因子IL-4，IL-10表達水平，降低IL-2、IFN-γ表達水平，并促進供受體嵌合，延長心臟移植物存活時間。胸腺注射和