廣州管圓線蟲(chóng)GAPDH基因的克隆表達(dá)及免疫診斷價(jià)值初步研究.pdf

1、廣州管圓線蟲(chóng)[Angiostrongylus cantonesis(Chen,1935)Doughert，1946]<'[1,2]>寄生于人體時(shí)引起嗜酸性粒細(xì)胞增多性腦膜腦炎或腦膜炎(Eosinophilic meningitis ormeningoencephalitis,EM)<'[3]>，是一種人獸共患食源性寄生蟲(chóng)病。廣州管圓線蟲(chóng)對(duì)人體的侵害主要累及中樞神經(jīng)系統(tǒng)，病情嚴(yán)重危害較大，如不及時(shí)治療可引起嚴(yán)重后果甚至死亡。然而近年來(lái)廣州

2、管圓線蟲(chóng)病的流行已經(jīng)由太平洋沿岸地區(qū)而波及美國(guó)、歐洲、澳大利亞等地區(qū)<'[4]>，我國(guó)的福建、臺(tái)灣以及其它地區(qū)曾發(fā)生了多次暴發(fā)流行<'[5-10]>。因此廣州管圓線蟲(chóng)病也引起了我國(guó)的廣泛的重視，2003年衛(wèi)生部將其列為新發(fā)傳染病<'[11]>。廣州管圓線蟲(chóng)寄生于多種鼠類的肺動(dòng)脈內(nèi)，一期幼蟲(chóng)隨宿主糞便一起排出體外，當(dāng)被吞入或主動(dòng)侵入中間宿主(螺類和蛞蝓等)體內(nèi)后，在組織中發(fā)育為第二及第三期幼蟲(chóng)，人因生食或半生食含本蟲(chóng)幼蟲(chóng)的中間宿主或轉(zhuǎn)續(xù)宿

3、主而感染<'1,12]>。廣州管圓線蟲(chóng)的能量代謝與其他寄生蟲(chóng)相似，獲取能量的重要方法就是無(wú)氧代謝，而3-磷酸甘油醛脫氫酶(Glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase，GAPDH)則是糖酵解過(guò)程中的一個(gè)重要酶，參與細(xì)胞的基本代謝。其催化3-磷酸甘油醛的醛基羧化而成為1，3-二磷酸甘油酸，在這一反應(yīng)過(guò)程中產(chǎn)生一個(gè)ATP。GAPDH還是一個(gè)多功能酶，它還在細(xì)胞發(fā)育、神經(jīng)細(xì)胞的凋亡和DNA的修復(fù)等過(guò)程中發(fā)揮重

4、要作用<'[13]>。此外，寄生蟲(chóng)的3-磷酸甘油醛脫氫酶具有一定的免疫原性<'[14-17]>。本研究利用分子生物學(xué)的方法對(duì)廣州管圓線蟲(chóng)的GAPDH基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析后克隆、構(gòu)建原核表達(dá)載體pET-30a-(+)-GAPDH、大量表達(dá)后獲得具有生物學(xué)活性的3-磷酸甘油醛脫氫酶目的蛋白，分析其免疫學(xué)活性，能否被感染的動(dòng)物血清和病人血清特異性識(shí)別，并為廣州管圓線蟲(chóng)病免疫學(xué)診斷的進(jìn)一步研究奠定基礎(chǔ)。研究目的本研究利用基因克隆和重組表達(dá)的方

5、法構(gòu)建廣州管圓線蟲(chóng)3-磷酸甘油醛脫氫酶基因的體外表達(dá)系統(tǒng)，獲得大量的3-磷酸甘油醛脫氫酶重組蛋白，用免疫印跡和酶聯(lián)免疫吸附反應(yīng)的方法進(jìn)一步分析免疫學(xué)活性，即目的蛋白作為抗原能否與廣州管圓線蟲(chóng)病人的血清和感染動(dòng)物血清特異性結(jié)合，以期為廣州管圓線蟲(chóng)病的實(shí)驗(yàn)室診斷研究提供參考。 研究方法利用生物信息學(xué)方法對(duì)廣州管圓線蟲(chóng)GAPDH基因序列進(jìn)行分析，找出其開(kāi)放讀碼框，PCR方法體外擴(kuò)增該基因進(jìn)行T-A克隆并進(jìn)而構(gòu)建原核表達(dá)載體pE﹪30a

6、(+)-GAPDH，轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21，對(duì)融合蛋白進(jìn)行表達(dá)。反復(fù)優(yōu)化并得到最佳表達(dá)條件后，在原核表達(dá)系統(tǒng)中進(jìn)行大量表達(dá)重組蛋白，制備細(xì)胞抽提物，經(jīng)Ni-NTAHis·Brad Resin親和層析柱進(jìn)行蛋白質(zhì)純化，SDS-PAGE方法進(jìn)行鑒定，免疫印跡和酶鏈免疫反應(yīng)的方法分析其與廣州管圓線蟲(chóng)病人血清和感染動(dòng)物血清結(jié)合的敏感性和特異性。 研究結(jié)果獲得了廣州管圓線蟲(chóng)GAPDH基因完整的開(kāi)放讀碼框，利用生物信息學(xué)的方法對(duì)該基因及其表

7、達(dá)的蛋白質(zhì)進(jìn)行了分析。成功克隆并擴(kuò)增目的基因，經(jīng)過(guò)T-A克隆獲得了高拷貝量的GAPDH目的基因，所構(gòu)建的融合表達(dá)載體pE﹪30a-(+)-GAPDH成功轉(zhuǎn)染入大腸桿菌BL21，經(jīng)過(guò)反復(fù)優(yōu)化表達(dá)條件該表達(dá)系統(tǒng)能夠在28-30℃、IVTG終濃度0.7-0.8mmol/L誘導(dǎo)7h的條件下大量、穩(wěn)定地表達(dá)目的蛋白，以非可溶性表達(dá)為主，在變性條件下純化該目的蛋白后進(jìn)行蛋白質(zhì)復(fù)性，SDS-PAGE結(jié)果顯示蛋白質(zhì)純化效率較好，成分純凈單一。以融合蛋白

8、作為抗原，用免疫印跡和酶聯(lián)免疫吸附反應(yīng)的方法觀察其與廣州管圓線蟲(chóng)病人血清和感染動(dòng)物血清結(jié)合的敏感性和特異性，結(jié)果表明該蛋白質(zhì)有一定的免疫學(xué)活性，但與其它寄生蟲(chóng)病人或動(dòng)物血清存有一定的交叉反應(yīng)性。 結(jié)論獲得了廣州管圓線蟲(chóng)3．磷酸甘油醛脫氫酶基因(GAPDH)的序列，初步對(duì)該基因進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，成功構(gòu)建了該基因的原核表達(dá)體系。該目的蛋白能夠與廣州管圓線蟲(chóng)病人血清和感染動(dòng)物的血清有結(jié)合反應(yīng)，但與其它寄生蟲(chóng)病人或動(dòng)物血清存有一定的