廣州管圓線蟲鈣網(wǎng)蛋白、14-3-3蛋白基因克隆、序列分析及免疫原性反應(yīng).pdf

1、鈣網(wǎng)蛋白(Calreticulin)是一種多功能蛋白，其功能包括Ca2+儲(chǔ)存與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、糖蛋白凝集素樣分子伴侶、基因表達(dá)調(diào)節(jié)、細(xì)胞黏附和自身免疫等。最近不少研究發(fā)現(xiàn)，鈣網(wǎng)蛋白與寄生蟲（包括盤尾絲蟲屬、血吸蟲屬、利什曼原蟲屬、瘧原蟲屬和板口線蟲屬等）感染免疫有密切關(guān)系。
　　 14-3-3是一蛋白家族，其成員為一系列廣泛表達(dá)并高度保守的酸性蛋白，它們可以自發(fā)形成可結(jié)合磷酸化絲氨酸/蘇氨酸位點(diǎn)的二聚體，該蛋白在真核細(xì)胞細(xì)胞信號(hào)活動(dòng)中

2、起到關(guān)鍵作用。在一些寄生蟲中，人們己純化得到14-3-3蛋白并對其特性進(jìn)行了研究。
　　 我們以廣州管圓線蟲為材料，在分析生物信息數(shù)據(jù)庫中積累的大量鈣網(wǎng)蛋白同源性序列的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)簡并引物，利用RT-PCR方法從廣州管圓線蟲cDNA中擴(kuò)增出約340bp的片段，然后結(jié)合RACE技術(shù)獲取全長序列，克隆廣州管圓線蟲鈣網(wǎng)蛋白基因的全長。同時(shí)以廣州管圓線蟲為材料，在分析生物信息數(shù)據(jù)庫中廣州管圓線蟲14-3-3蛋白基因EST序列的基礎(chǔ)上，設(shè)

3、計(jì)特異引物，利用RT-PCR方法并結(jié)合RACE技術(shù)獲取全長序列，克隆廣州管圓線蟲14-3-3蛋白基因的全長。利用NCBI，signalP等多種在線分析軟件預(yù)測其鈣網(wǎng)蛋白和14-3-3蛋白的結(jié)構(gòu)及進(jìn)行功能分析。鈣網(wǎng)蛋白表達(dá)部分用SalⅠ和XhoⅠ雙酶切，并連入表達(dá)載體pET32a(+)。經(jīng)SalⅠ和XhoⅠ雙酶切和測序鑒定，將構(gòu)建的原核表達(dá)質(zhì)粒pET32a(+)-AcCRT轉(zhuǎn)入大腸埃希菌BL21(DE3)中進(jìn)行表達(dá)并純化。結(jié)果表明該基因全

4、長1497bp，編碼401個(gè)氨基酸，表達(dá)蛋白純化后在62KD附近得到單一蛋白帶。成功克隆并表達(dá)純化鈣網(wǎng)蛋白后進(jìn)一步研究該蛋白的抗原性，為其功能的研究做基礎(chǔ)。14-3-3蛋白表達(dá)部分用EcoRⅠ和SalⅠ雙酶切，并連入表達(dá)載體pET32a(+)。經(jīng)EcoRⅠ和SalⅠ雙酶切和測序鑒定，構(gòu)建的原核表達(dá)質(zhì)粒pET32a(+)-Ac14-3-3轉(zhuǎn)入大腸埃希菌BL21(DE3)中進(jìn)行表達(dá)并純化。結(jié)果表明該基因全長949bp，編碼251個(gè)氨基酸，表