廣州管圓線蟲LDH基因的克隆、表達(dá)及免疫診斷價(jià)值初步研究.pdf

1、中山大學(xué)碩士學(xué)位論文廣州管圓線蟲LDH基因的克隆、表達(dá)及免疫診斷價(jià)值初步研究姓名：程梅申請學(xué)位級別：碩士專業(yè)：病原生物學(xué)指導(dǎo)教師：詹希美20060501廣州管圓線蟲LDH基因的克隆，表達(dá)及免疫診斷價(jià)值初步研究中文摘要同工酶，是糖酵解途徑的末端酶，利用NADH為輔酶，催化丙酮酸和乳酸之間的氧化和還原反應(yīng)。LDH的同工酶在組織分布，動力學(xué)特征，理化性質(zhì)及免疫學(xué)特性等方面均有很大不同。在人體，LDH已成為一種常用的臨床醫(yī)用診斷用酶。已知絕大多

2、數(shù)體內(nèi)寄生蟲能量代謝的主要途徑是無氧糖酵解，因此研究寄生蟲LDH與宿主LDH在分子結(jié)構(gòu)及功能上的差異對于寄生蟲的能量代謝、寄生蟲病的免疫診斷、疫苗研究和新抗蟲藥物的研發(fā)都有著重要的意義。研究目的：解析廣州管圓線蟲LDH基因的結(jié)構(gòu)及其特點(diǎn)，構(gòu)建LDH基因的原核表達(dá)系統(tǒng)，優(yōu)化表達(dá)條件，鑒定重組LDH基因的免疫反應(yīng)性，以期獲得能用于廣州管圓線蟲病診斷的基因工程重組抗原。研究方法：從廣州管圓線蟲幼蟲eDNA文庫隨機(jī)測序得到的全長Unigene中

3、識別出編碼LDH的基因，用生物信息學(xué)方法對其進(jìn)行結(jié)構(gòu)預(yù)測及同源性比較，用PCR方法從幼蟲eDNA文庫中擴(kuò)增出該基因，測序，定向克隆到原核表達(dá)載體pET30a()，在大腸桿菌BL21中表達(dá)，優(yōu)化表達(dá)條件，得到高效表達(dá)的工程菌pET30a()LDH，按照Ni—IDAHisBindPurificationKit說明書純化重組蛋白，用十二烷基硫酸鈉一聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDSPAGE)分析。用廣州管圓線蟲病人血清及廣州管圓線蟲感染的不同時(shí)期小鼠

4、血清進(jìn)行免疫印跡鑒定純化蛋白的免疫反應(yīng)性，并進(jìn)行ELISA分析。研究結(jié)果：1廣州管圓線蟲LDH基因全長1008bp，編碼335個(gè)氨基酸，氨基酸序列的理論分子量(Mw)為3666kDa，等電點(diǎn)(pI)為838。氨基酸序列與秀麗隱桿線蟲LDH的同源性最高，達(dá)72％(237／328)，與果蠅LDH的同源性為62％，與華支睪吸蟲LDH、日本血吸蟲LDH的同源性分別為52％和55％，與剛地弓形蟲LDH及惡性瘧原蟲LDH的同源性分別為25％和24％