大黃酸及其衍生物二乙酰大黃酸對(duì)關(guān)節(jié)軟骨損傷保護(hù)作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的： 1．研究關(guān)節(jié)軟骨損傷后關(guān)節(jié)內(nèi)組織中促炎癥細(xì)胞因子和轉(zhuǎn)錄因子的變化，探討創(chuàng)傷性骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)病機(jī)理。 2．研究大黃酸及其衍生物二乙酰大黃酸對(duì)關(guān)節(jié)軟骨損傷后關(guān)節(jié)內(nèi)和血清中促炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)的抑制作用，為其臨床使用提供理論依據(jù)。 方法： 1．通過6.3J，0.9J能量直接撞擊兔膝關(guān)節(jié)軟骨建立高能量組(H組)、低能量組(L組)關(guān)節(jié)軟骨損傷模型。 2．通過酶消化法分離培養(yǎng)高能量、低能量撞擊后和正常兔

2、膝關(guān)節(jié)的透明軟骨細(xì)胞，通過Trypan Blue染色、繪制細(xì)胞生長曲線觀察創(chuàng)傷能量對(duì)軟骨細(xì)胞生存能力的影響；用甲苯胺藍(lán)染色、Ⅱ型膠原免疫組化染色檢測(cè)軟骨細(xì)胞合成蛋白多糖和Ⅱ型膠原能力；用RT-PCR檢測(cè)細(xì)胞中IL-1B和NF-kB mRNA表達(dá)水平：用ELISA方法檢測(cè)細(xì)胞合成IL-1β和MMP-1的情況。用大黃酸、透明質(zhì)酸鈉、N-乙酰氨基葡萄糖對(duì)高能量損傷組軟骨細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)，研究大黃酸對(duì)創(chuàng)傷后軟骨細(xì)胞的治療作用。 3．通過組織

3、塊培養(yǎng)法獲取三組動(dòng)物關(guān)節(jié)中的B型滑膜細(xì)胞，用RT-PCR檢測(cè)細(xì)胞中IL-1β和NF-kB mRNA表達(dá)水平；用ELISA方法檢測(cè)細(xì)胞合成IL-1β和MMP-1的情況，用大黃酸、透明質(zhì)酸鈉、N-乙酰氨基葡萄糖對(duì)滑膜細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)，研究這些藥物對(duì)創(chuàng)傷后滑膜細(xì)胞的治療作用。 4．將高能量組、低能量組和對(duì)照組動(dòng)物于術(shù)后1，2，4，8，16，32取材，觀察關(guān)節(jié)軟骨損傷程度，滑膜組織反應(yīng)，用番紅O染色檢測(cè)軟骨中蛋白多糖含量；用免疫組化染色定位

4、和定量軟骨和滑膜組織中IL-1B和NF-kB的表達(dá)；ELISA定量檢測(cè)關(guān)節(jié)液和血清中IL-1β和MMP-1水平。探討炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)與軟骨退變之間的關(guān)系。 5．幾種藥物對(duì)關(guān)節(jié)軟骨損傷的保護(hù)作用研究：實(shí)驗(yàn)分為A，B，C，D，E組，A組：生理鹽水組，B組：二乙酰大黃酸組，C組：塞來昔布組，D組：透明質(zhì)酸組，E組：N-乙酰氨基葡萄糖組。采用管喂和關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射方式給藥4周，于術(shù)后1，2，4，8周分別抽取關(guān)節(jié)液和血清，用ELISA定量檢

5、測(cè)其中IL-1β和MMP-1水平；術(shù)后8周取關(guān)節(jié)軟骨和滑膜組織，組織學(xué)觀察其退變和炎性細(xì)胞浸潤情況；番紅O檢測(cè)軟骨中蛋白多糖含量；免疫組化染色定位和定量檢測(cè)軟骨和滑膜組織中IL-1B和NF-kB的表達(dá)。 結(jié)果： 1. 關(guān)節(jié)軟骨損傷后，軟骨細(xì)胞的存活率下降，原代細(xì)胞的貼壁細(xì)胞數(shù)量減少，貼壁時(shí)間延長，生長曲線下移，細(xì)胞甲苯胺藍(lán)染色異染反應(yīng)減弱，Ⅱ型膠原免疫組化染色強(qiáng)度減弱，軟骨細(xì)胞中IL-1β和NF-KBmRNA表達(dá)水平上升

6、，細(xì)胞培養(yǎng)液中IL-1β和MMP-1的含量升高，各組之間的變化程度為高能量組>低能量組>對(duì)照組，各組之間的差異明顯(0<0.05)。 2. 用大黃酸、透明質(zhì)酸鈉、N-乙酰氨基葡萄糖對(duì)高能量損傷組軟骨細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)后，軟骨細(xì)胞合成蛋白多糖和Ⅱ型膠原的能力上升，細(xì)胞內(nèi)IL-1β和NF-kB mRNA的表達(dá)及細(xì)胞培養(yǎng)液中IL-1β和MMP-1的含量降低，差異明顯(p<0.05)，且作用的強(qiáng)度與藥物濃度存在劑量效應(yīng)關(guān)系，藥物濃度越高，作用

7、效果越明顯。 3. 體外培養(yǎng)關(guān)節(jié)軟骨創(chuàng)傷后的B型滑膜細(xì)胞，IL-1B和NF-kB mRNA表達(dá)明顯上調(diào)，細(xì)胞合成IL-1β和MMP-1能力的增加，采用大黃酸、透明質(zhì)酸鈉、N-乙酰氨基葡萄糖對(duì)所獲得的B型滑膜細(xì)胞進(jìn)行體外干預(yù)后，細(xì)胞中IL-1β和NF-kB mRNA表達(dá)明顯下調(diào)(p<0.05)，細(xì)胞合成ILlB和MMP-1能力下降(p<0.05)。 4. 高、低能量撞擊后，關(guān)節(jié)液和血清中IL-1β和MMP-1含量均明顯增高

8、，與對(duì)照組相比有顯著差異(p<0.05)，低能量組在傷后4周IL-1β和MMP-1恢復(fù)到對(duì)照組水平，高能量組則始終保持在較高水平上。 5. 高、低能量撞擊后軟骨和滑膜組織中IL-1β和NF-kB的陽性表達(dá)均增強(qiáng)，低能量組主要集中在關(guān)節(jié)軟骨的淺表層和滑膜組織的襯里層，4周后陽性細(xì)胞率與正常對(duì)照無明顯差異(p>0.05)。高能量組在關(guān)節(jié)軟骨全層和滑膜襯里下層內(nèi)均有陽性表達(dá)，在傷后時(shí)間越長，陽性細(xì)胞率越高，與低能量組和對(duì)照組之間均有顯

9、著差異(p<0.05)。陽性細(xì)胞數(shù)目與軟骨退變的程度一致。 6. 高能量撞擊關(guān)節(jié)軟骨，給于藥物治療后，各組關(guān)節(jié)液和血清中IL-1β和MMP-1含量均明顯下降(p<0.05)，軟骨和滑膜組織中IL-1β和NF-kB的陽性表達(dá)均下降(p<0.05)，在治療后1～2周，以C、D、E組的作用較強(qiáng)，治療4周后，B組的作用強(qiáng)度最強(qiáng)。8周后，各治療組番紅O染色提示軟骨基質(zhì)中蛋白多糖含量比A組明顯增加(p<0.05)，強(qiáng)度依次為B組>C組>D組

10、>E組>A組。 結(jié)論： 1. 關(guān)節(jié)軟骨損傷后，軟骨細(xì)胞和滑膜細(xì)胞中IL-1β和NF-kB的表達(dá)增加，IL-1β和MMP-1的合成增加，與損傷能量的大小成正相關(guān)，與軟骨細(xì)胞的生存能力和合成細(xì)胞外基質(zhì)的能力成負(fù)相關(guān)，表明不同程度創(chuàng)傷后軟骨細(xì)胞功能的受損程度與細(xì)胞因子IL-1β和MMP-1，轉(zhuǎn)錄因子NF-kB的表達(dá)相關(guān)。 2. 低能量損傷后關(guān)節(jié)軟骨和滑膜表層細(xì)胞中IL-1β和NF-kB表達(dá)輕度升高，持續(xù)到傷后4周后恢復(fù)

11、正常，不引起關(guān)節(jié)軟骨的進(jìn)性破壞。 3. 高能量損傷后全層關(guān)節(jié)軟骨和滑膜細(xì)胞中IL-1β和NF-kB mRNA的表達(dá)、關(guān)節(jié)液和血清中IL-1β和MMP-1含量均維持在較高水平，關(guān)節(jié)軟骨進(jìn)行性破壞，說明關(guān)節(jié)軟骨受到高能量撞擊后，軟骨組織和細(xì)胞受到的損傷不能自行修復(fù)，引起關(guān)節(jié)軟骨逐漸退變。 4. IL-1β和MMP-1的水平與關(guān)節(jié)軟骨退變進(jìn)程一致，其變化規(guī)律能夠反映傷情的轉(zhuǎn)歸，NF-kB在關(guān)節(jié)組織內(nèi)的活化程度與IL-1β和MM

12、P．1表達(dá)的強(qiáng)度緊密相關(guān)。IL-1β、MMP-1和NF-kB可以反映關(guān)節(jié)軟骨退變程度和治療效果。 5. 大黃酸、透明質(zhì)酸鈉和N-乙酰氨基葡萄糖能夠增加體外培養(yǎng)的受損軟骨細(xì)胞合成蛋白多糖和Ⅱ型膠原的能力，對(duì)軟骨細(xì)胞的生長、增殖有促進(jìn)作用，并且這種作用的強(qiáng)度與藥物濃度存在劑量效應(yīng)關(guān)系。同時(shí)，三種藥物能有效降低受損軟骨細(xì)胞和滑膜細(xì)胞中IL-1β、NF-kBmRNA水平和IL-1β、MMP-1的合成。 6. 二乙酰大黃酸、透明質(zhì)