沒食子酸衍生物ZXHA-TC對(duì)兔骨關(guān)節(jié)炎軟骨退變的體內(nèi)外作用研究.pdf

1、目的:探討沒食子酸衍生物ZXHA-TC對(duì)OA中軟骨退變的作用。
　　方法:利用SYBYL軟件設(shè)計(jì)IL-1β的抑制劑;以沒食子酸為母核合成ZXHA-TC并對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行鑒定。
　　采用兩步酶消化法對(duì)乳兔關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞進(jìn)行分離培養(yǎng)，MTT試驗(yàn)檢測(cè)ZXHA-TC及GA的毒性，ZXHA-TC及GA分別對(duì)軟骨細(xì)胞干預(yù)1h后，加入IL-1β刺激24h，提取RNA檢測(cè)MMP-1、MMP-13及TIMP-1基因的表達(dá)水平，并用免疫組織化學(xué)染色觀

2、察MMP-1及Timp-1蛋白表達(dá)情況。2、4、6天后通過HE染色法、番紅O染色法、FDA/PI熒光染色法、免疫組織化學(xué)染色法及qRT-PCR法等研究ZXHA-TC對(duì)軟骨細(xì)胞生物學(xué)特性的影響。
　　從44只新西蘭兔隨機(jī)抽取8只作為正常對(duì)照組（A組），其余36只行雙膝關(guān)節(jié)前交叉韌帶離斷術(shù)，8周后4只經(jīng)大體檢查及病理取材確定成OA模型，隨后隨機(jī)分為:模型組（B組）與受試藥物組(C組)，每組16只。按設(shè)定劑量關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射給藥（正常對(duì)照組

3、不做任何處理，模型組注射生理鹽水）0.5mL，每周一次。給藥4周、8周后，分別處死動(dòng)物，取股骨內(nèi)髁軟骨標(biāo)本，進(jìn)行大體形態(tài)學(xué)Pelletier評(píng)分;固定，脫鈣后石蠟包埋并切片，HE、Masson及番紅O染色并行Mankin軟骨評(píng)分，通過qRT-PCR與免疫組織化學(xué)染色法檢測(cè)相關(guān)基因及蛋白的表達(dá)，并使用免疫蛋白印記探索ZXHA-TC抑制骨關(guān)節(jié)炎可能的作用機(jī)制。
　　結(jié)果:根據(jù)SYBYL軟件計(jì)算出IL-1β蛋白的“活性口袋”坐標(biāo)并得到先

4、導(dǎo)化合物GA;對(duì)GA進(jìn)行結(jié)構(gòu)優(yōu)化得到ZXHA-TC，其與“活性口袋”形成穩(wěn)定的復(fù)合物，表明其對(duì)IL-1β的活性可能具有明顯的抑制作用。
　　通過MTT試驗(yàn)，ZXHA-TC在濃度為6.25×10-7μg/mL，6.25×10-6μg/mL及6.25×10-5μg/mL時(shí)促進(jìn)兔關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的增殖，而沒食子酸在0.125μg/mL時(shí)對(duì)細(xì)胞的毒性相對(duì)較低。經(jīng)IL-1β誘導(dǎo)，ZXHA-TC在濃度為6.25×10-6μg/mL時(shí)，能明顯抑制M

5、MP-1及MMP-13的表達(dá)，而增加Timp-1的表達(dá)。軟骨細(xì)胞在培養(yǎng)2、4、6天后，F(xiàn)DA/PI熒光染色顯示ZXHA-TC能很好地維持軟骨細(xì)胞活性;番紅O染色及DMMB試驗(yàn)顯示，GAG的分泌量在ZXHA-TC組時(shí)最高;免疫組織化學(xué)染色發(fā)現(xiàn)Ⅱ型膠原在ZXHA-TC干預(yù)下的分泌較空白對(duì)照組及GA組多，而Ⅰ型膠原蛋白的表達(dá)量則相反;經(jīng)ZXHA-TC的干預(yù)，DNA含量明顯高于空白對(duì)照組及GA組;而qRT-PCR結(jié)果顯示ZXHA-TC組的蛋白聚

6、糖、Sox9及Ⅱ型膠原基因的表達(dá)高于空白對(duì)照組及GA組，而Ⅰ型膠原基因的則相反，Ⅹ型膠原基因未檢測(cè)到有表達(dá)。
　　對(duì)大體觀察股骨髁并進(jìn)行評(píng)分，A組得分最低，B組4周及8周平均得分分別為2.63±0.74和3.25±0.71，C組4周及8周平均得分分別為1.38±0.52和2.25±0.89。Mankin組織學(xué)評(píng)分，A組的得分最低(0.34±0.01)，給藥4周后，C組（1.37±0.06）得分低于B組（3.54±0.12）;給藥8

7、周后，C組（2.15±0.11）得分遠(yuǎn)低于B組（5.83±0.32），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)。qRT-PCR檢測(cè)相關(guān)基因表達(dá)，B組MMPs的表達(dá)遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于A組于C組，而Timp-1的表達(dá)在C組最高;p38及NF-κB在B組的表達(dá)明顯高于C組。另外，ZXHA-TC可能可以阻斷骨關(guān)節(jié)炎MAPK/p38及TLR/NF-κB通路以抑制骨關(guān)節(jié)炎的進(jìn)程。
　　結(jié)論:經(jīng)藥物虛擬篩選得到IL-1β抑制劑ZXHA-TC，其對(duì)體外培養(yǎng)的關(guān)節(jié)軟