細(xì)胞周期檢測點激酶1在急性白血病細(xì)胞耐藥中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、腫瘤細(xì)胞耐藥是臨床上復(fù)發(fā)性和難治性白血病化療失敗的主要原因之一，經(jīng)典的多藥耐藥(multidrugresistance，MDR)機(jī)制并不能完全解釋腫瘤細(xì)胞的耐藥現(xiàn)象及徹底逆轉(zhuǎn)耐藥性。因此，深入研究白血病細(xì)胞的耐藥發(fā)生機(jī)制并探討逆轉(zhuǎn)策略極其重要。 細(xì)胞周期檢測點信號通路是細(xì)胞的一種自我保護(hù)機(jī)制。50％以上的腫瘤細(xì)胞因p53基因功能缺陷致使G1/S期檢測點的阻滯作用缺失，當(dāng)細(xì)胞受到放化療損傷后，絕大部分停滯在G2/M期，修復(fù)受損的D

2、NA，從而提高腫瘤細(xì)胞的抗損傷能力而導(dǎo)致腫瘤的耐藥。 細(xì)胞周期檢測點激酶1(checkpointkinase1，Chk1)是G2/M檢測點活化的重要效應(yīng)分子，能直接參與調(diào)控DNA損傷修復(fù)和細(xì)胞凋亡，在維護(hù)基因組穩(wěn)定性方面具有較強(qiáng)作用。Chk1的高表達(dá)及酶活性升高是導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞增殖活性和抗凋亡能力增強(qiáng)的重要原因；抑制Chk1表達(dá)則增加了諸多化療藥物(如Topo抑制劑、抗代謝類藥物、抗微管類藥物等)的細(xì)胞毒效應(yīng)?？梢酝茢?，Chk1信

3、號通路是影響腫瘤細(xì)胞對化療藥物敏感性的關(guān)鍵因素。但在以P-糖蛋白(P-glycoprotein，P-gp)介導(dǎo)耐藥為主的細(xì)胞中，Chk1信號通路是否也發(fā)揮同樣作用尚不清楚。因此，本課題以人紅白血病耐藥細(xì)胞株K562/A02(耐阿霉素)為研究對象，探討Chk1對白血病細(xì)胞耐藥的調(diào)控機(jī)制；隨后應(yīng)用RNA干擾技術(shù)沉默Chk1基因，觀察Chk1在白血病細(xì)胞耐藥中的作用；并進(jìn)一步研究聯(lián)合阻斷Chk1信號通路與P-gp泵功能兩條途徑對逆轉(zhuǎn)K562/

4、A02細(xì)胞耐藥性的作用，為臨床上克服白血病細(xì)胞化療耐藥提供更為有效的作用靶點及治療途徑。 第一部分Chk1引起的G2/M期阻滯在K562/A02細(xì)胞耐藥機(jī)制中的研究 目的：研究Chk1對白血病細(xì)胞周期分布的影響，探討Chk1調(diào)控腫瘤細(xì)胞耐藥的機(jī)制。 方法：以人紅白血病細(xì)胞系K562及其耐藥細(xì)胞株為K562/A02研究對象，與阿霉素共同孵育后，流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期分布，RT-PCR檢測Chk1mRNA表達(dá)水平，W

5、estern-blot檢測其蛋白質(zhì)及磷酸化水平的表達(dá)。 結(jié)果：阿霉素致K562/A02細(xì)胞阻滯在G2/M期的細(xì)胞百分率為(54.12±0.57)％，顯著高于K562細(xì)胞的(36.99±1.28)％；Chk1mRNA及蛋白表達(dá)水平在K562與K562/A02細(xì)胞間無顯著差異；Chk1磷酸化水平在K562/A02細(xì)胞為0.79±0.56，K562細(xì)胞為0.27±1.47，其差異有顯著性意義。 結(jié)論：G2/M期阻滯是導(dǎo)致白血病

6、細(xì)胞耐藥的機(jī)制之一，Chk1磷酸化水平與G2/M期阻滯密切相關(guān)，提示Chk1的活化狀態(tài)參與調(diào)控白血病細(xì)胞耐藥的形成。 第二部分Chk1基因沉默增強(qiáng)K562/A02細(xì)胞對阿霉素敏感性的實驗研究 目的：研究Chk1基因沉默對K562/A02細(xì)胞生長的影響，探討Chk1在白血病細(xì)胞耐藥中的作用。 方法：通過電穿孔轉(zhuǎn)染法將特異性靶向Chk1的短發(fā)卡狀RNA(shorthairpinRNA，shRNA)導(dǎo)入K562/A02

7、細(xì)胞，應(yīng)用RT-PCR、Western-blot檢測細(xì)胞內(nèi)Chk1的表達(dá)，流式細(xì)胞術(shù)(FCM)檢測其細(xì)胞周期分布及細(xì)胞的凋亡率，MTT法測細(xì)胞的增殖。 結(jié)果：與對照組和空載體轉(zhuǎn)染組相比，shRNA使細(xì)胞中Chk1mRNA水平下降了66％，蛋白水平下降了60％。抑制Chk1的表達(dá)可解除阿霉素引起的G2/M期阻滯；使阿霉素誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡率由轉(zhuǎn)染前的(5.67±0.78)％上升到(19.25±1.41)％；在阿霉素濃度0.4mg/L、

8、4mg/L時，細(xì)胞的增殖活性分別下降12％、20％。 結(jié)論：靶向Chk1的shRNA能有效下調(diào)Chk1的基因表達(dá)，繼而解除阿霉素誘導(dǎo)的G2/M阻滯，促進(jìn)細(xì)胞凋亡及增強(qiáng)K562/A02細(xì)胞對阿霉素的敏感性，提示抑制Chk1表達(dá)是逆轉(zhuǎn)白血病細(xì)胞化療耐藥的靶點之一。 第三部分Chk1shRNA聯(lián)合環(huán)胞素A逆轉(zhuǎn)K562/A02細(xì)胞耐藥的實驗研究 目的：研究聯(lián)合阻斷Chk1信號通路與P-gp泵功能兩條途徑對逆轉(zhuǎn)K562/A

9、02細(xì)胞耐藥性的作用，探索有效的克服白血病細(xì)胞耐藥的策略。 方法：MTT法測定CsA的非細(xì)胞毒性劑量；Chk1shRNA與CsA聯(lián)用后，MTT法檢測細(xì)胞的藥物敏感性；流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期及細(xì)胞內(nèi)阿霉素濃度的變化。 結(jié)果：CsA濃度低于2.95±0.39mg/L時對K562/A02細(xì)胞的生長抑制率小于10％。Chk1shRNA聯(lián)合CsA(1mg/L)使阿霉素對K562/A02細(xì)胞的IC50值由原來的109.65

10、±0.26mg/L降至2.44±0.51mg/L，逆轉(zhuǎn)倍數(shù)為45倍，明顯增加了細(xì)胞敏感性；細(xì)胞凋亡率升至(66.74±1.62)％，與Chk1shRNA或CsA單獨處理組相比有顯著差異。Chk1shRNA與CsA單獨或聯(lián)用均導(dǎo)致G2/M期細(xì)胞百分率顯著下降，分別為(17.10±0.63)％、(14.60±0.97)％、(18.21±1.13)％，三者間無顯著差異，但聯(lián)用組有明顯的亞G1峰。Chk1shRNA聯(lián)合CsA組細(xì)胞內(nèi)阿霉素濃度為