OsNOA1調(diào)控葉綠體蛋白合成的機(jī)理研究.pdf

1、一氧化氮（NO）是一種重要的信號物質(zhì)。在動物體中，NO已被證明與多種代謝途徑有關(guān)：包括神經(jīng)傳遞、免疫以及血管平滑肌的松弛過程等。在植物體中，NO也被證明參與到呼吸作用、光形態(tài)建成、種子萌發(fā)、根葉的生長發(fā)育、氣孔運(yùn)動的調(diào)節(jié)、衰老等多種生理過程中。動物主要通過L-精氨酸依賴的NOS途徑來合成體內(nèi)的NO。而關(guān)于植物體中NO合成途徑的研究目前還存在諸多爭議，但研究者們普遍接受在植物體中普遍存在兩種互不關(guān)聯(lián)的NO合成途徑:即硝酸/亞硝酸還原酶依賴

2、的NO合成途徑以及類似于動物的以L-精氨酸為底物的一氧化氮合酶（NOS）依賴的NO合成途徑。2003年，Guo等報(bào)道了擬南芥中的一氧化氮合酶—AtNOS1。然而，后續(xù)的多項(xiàng)相關(guān)研究都表明AtNOS1并不具有NOS活性，它只是間接影響了擬南芥細(xì)胞內(nèi)部NO的含量。AtNOS1也由此被重新命名為AtNOA1，意為一氧化氮合成相關(guān)蛋白1。盡管NOA1并不具有NO合酶的活性，但NOA1的缺失突變體仍然因?yàn)榫哂休^低的NO水平而存在研究價值。本研究室

3、的前期研究發(fā)現(xiàn)：OsNOA1的干涉植株在22℃條件下生長時表現(xiàn)出黃化表型；而在30℃條件下生長時，干涉植株與野生型水稻卻無明顯表型差異?；谝陨蟽牲c(diǎn)，本文以干涉植株（OsNOA1-RNAi）與超表達(dá)植株（OsNOA1-Ox）為材料研究了OsNOA1轉(zhuǎn)基因水稻低溫敏感表型的內(nèi)在機(jī)理及低溫敏感表型與轉(zhuǎn)基因植株中NO水平的關(guān)系。主要研究結(jié)果如下：
　　1.干涉與超表達(dá)OsNOA1轉(zhuǎn)基因水稻的比較分析
　　通過表型觀察、葉綠素與Ru

4、bisco含量測定等實(shí)驗(yàn)，我們發(fā)現(xiàn)OsNOA1超表達(dá)株系表現(xiàn)出與干涉植株相類似的低溫敏感黃化表型。并且在低溫條件下，超表達(dá)植株的葉綠素與Rubisco含量隨著OsNOA1表達(dá)量的提高而逐漸降低。葉綠素與Rubisco代謝途徑相關(guān)基因的定量RT-PCR分析結(jié)果表明：低溫處理?xiàng)l件下，干涉植株與OsNOA1上調(diào)較多的超表達(dá)株系（OsNOA1-Ox line22；OsNOA1-Ox line45）中葉綠素與蛋白的合成代謝都受到了不同程度的影響，

5、而在常溫條件下轉(zhuǎn)基因植株中這些代謝途徑受到的影響不明顯。通過溫度轉(zhuǎn)換實(shí)驗(yàn)證明，OsNOA1對葉綠體蛋白的合成起到了調(diào)控作用。定量蛋白質(zhì)組學(xué)分析結(jié)果表明，干涉植株與超表達(dá)植株中顯著差異蛋白的生物學(xué)過程極為相似，進(jìn)一步說明顯著下調(diào)或者上調(diào)OsNOA1對水稻蛋白合成機(jī)制所造成的影響是類似的。對蛋白質(zhì)表達(dá)譜進(jìn)行的GO分析也表明OsNOA1與葉綠體蛋白質(zhì)的合成密切相關(guān)。
　　2.OsNOA1轉(zhuǎn)基因植株的低溫敏感表型與NO的關(guān)系
　　在

6、低溫條件下（22℃）,向木村B培養(yǎng)基中添加外源NO供體SNP并不能挽救OsNOA1干涉植株的黃化表型，以Rubisco大小亞基為代表的葉綠體蛋白在SNP處理前后也無明顯變化。因此，OsNOA1轉(zhuǎn)基因植株的低溫敏感表型與NO含量之間并無直接聯(lián)系。
　　半定量RT-PCR鑒定到OsNOA1干涉植株中積累了大量的葉綠體16S rRNA前體，表明OsNOA1與葉綠體30S核糖體小亞基的功能相關(guān)，葉綠體核糖體功能受損可能是造成OsNOA1轉(zhuǎn)

7、基因植株低溫敏感表型的直接原因。
　　3.OsNOA1互作蛋白的分辨
　　使用STRING蛋白互作數(shù)據(jù)庫預(yù)測了OsNOA1的互作蛋白。結(jié)果表明：核糖體蛋白很可能是OsNOA1的互作對象。本文利用多種方法篩查了OsNOA1的互作蛋白，并通過體外His-tag pull down實(shí)驗(yàn)成功篩選到了與OsNOA1互作的靶蛋白，其中包含葉綠體30S核糖體蛋白S2等多種葉綠體核糖體蛋白。上述結(jié)果表明OsNOA1的功能確實(shí)與葉綠體核糖體相

8、關(guān)。
　　4.葉綠體逆行信號在OsNOA1調(diào)控葉綠體蛋白合成過程中的作用
　　通過熒光HPLC測定了低溫下生長的OsNOA1干涉植株與野生型水稻中鎂原卟啉IX（Mg-Proto IX）的含量。結(jié)果表明：干涉植株中的Mg-Proto IX大量積累。因此，OsNOA1有可能通過Mg-Proto IX介導(dǎo)的葉綠體逆行信號通路來調(diào)控細(xì)胞核編碼的葉綠體基因的表達(dá)。同時，通過基于Cre-loxP重組體系的多基因干涉系統(tǒng)，構(gòu)建并轉(zhuǎn)化了Os

9、NOA1與OsGUN1的雙基因干涉載體，獲得了OsNOA1與OsGUN1表達(dá)量同時下調(diào)的雙基因干涉水稻植株。但我們發(fā)現(xiàn)下調(diào)OsGUN1的表達(dá)量并不能挽救OsNOA1表達(dá)量下調(diào)所導(dǎo)致的低溫敏感表型，意味著OsNOA1不是通過OsGUN1介導(dǎo)的逆行信號通路來實(shí)現(xiàn)對核編碼的葉綠體基因的調(diào)控。
　　綜合上述結(jié)果，表明OsNOA1可能通過影響葉綠體核糖體的功能實(shí)現(xiàn)對葉綠體自編碼蛋白的直接調(diào)控，繼而通過鎂原卟啉IX介導(dǎo)的葉綠體逆行信號通路將信