羊流產(chǎn)衣原體細(xì)胞滅活疫苗的研究.pdf

1、流產(chǎn)衣原體（Chlamydia abortus）是專(zhuān)性細(xì)胞內(nèi)寄生的、革蘭氏陰性細(xì)菌。流產(chǎn)衣原體是羊地方性流產(chǎn)（OEA）的病原，能引起豬、牛等多種脊椎動(dòng)物在妊娠晚期發(fā)生流產(chǎn)，主要寄生于這些動(dòng)物生殖道黏膜表面的上皮細(xì)胞內(nèi)，造成生殖道黏膜損傷，導(dǎo)致母畜流產(chǎn)、產(chǎn)死胎、弱胎等，引發(fā)公畜睪丸炎、包皮炎、尿道炎等，偶爾也會(huì)感染妊娠婦女，引起急性感染或流產(chǎn)。所以，流產(chǎn)衣原體也是一種人獸共患病病原，其防控研究具有重要的公共衛(wèi)生及經(jīng)濟(jì)意義。
　　本研

2、究利用接種雞胚卵黃囊的方法從甘肅省肅南縣分離到一株羊衣原體，根據(jù)GenBank公布的流產(chǎn)衣原體helicase gene clone8的核苷酸序列，設(shè)計(jì)衣原體helicase gene clone8的引物，參考相關(guān)文獻(xiàn)，進(jìn)行了PCR-RFLP試驗(yàn)，PCR產(chǎn)物經(jīng)Alu I酶切后原本479 bp大小的基因被切為兩個(gè)小片段，與S26/3流產(chǎn)衣原體標(biāo)準(zhǔn)株一致，由此可鑒定為流產(chǎn)衣原體。
　　本研究采用了Hela細(xì)胞、BHK細(xì)胞、L929細(xì)胞

3、、McCoy細(xì)胞這四種細(xì)胞，分別接種分離到的羊流產(chǎn)衣原體進(jìn)行培養(yǎng)，通過(guò)Giemsa染色的方法觀察不同細(xì)胞的感染率，選出對(duì)羊流產(chǎn)衣原體最為敏感的細(xì)胞為 Hela細(xì)胞，進(jìn)行了衣原體的擴(kuò)大培養(yǎng)，收集的衣原體滴度測(cè)定為1.2735×105 IFU/mL，并利用電子顯微鏡觀察流產(chǎn)衣原體的形態(tài)，可以看到呈球形或橢球形的、小而致密的顆粒結(jié)構(gòu)為原體（EB），直徑為0.2~0.5μm，另一種具有大而疏松的結(jié)構(gòu)為網(wǎng)狀體（RB），直徑為0.6~1.5μm。<

4、br>　　本研究進(jìn)行了羊流產(chǎn)衣原體細(xì)胞滅活苗的研究，主要從滅活劑和佐劑的篩選方面展開(kāi)，以Balb/c小鼠為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，進(jìn)行免疫，最終選擇了以甲醛滅活、206+CpG為佐劑制備羊流產(chǎn)衣原體細(xì)胞滅活苗。免疫組小鼠血清抗體IHA檢測(cè)效價(jià)達(dá)到1：65536；抗體亞型的測(cè)定結(jié)果為IgG1型，輕鏈主要為κ鏈；免疫組小鼠血清以及淋巴細(xì)胞培養(yǎng)上清中的IFN-γ含量均比生理鹽水對(duì)照組的高；遲發(fā)型超敏反應(yīng)（DTH）檢測(cè)免疫組小鼠足墊增厚厚度顯著大于生理鹽水組

5、；淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)中C. abortus刺激孔的淋巴細(xì)胞增殖比刀豆球蛋白（ConA）刺激孔和陰性對(duì)照孔都顯著；中和試驗(yàn)中免疫組血清中和后的C. abortus接種細(xì)胞形成的包涵體數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于生理鹽水組的IFU數(shù)量；攻毒試驗(yàn)中生理鹽水組小鼠的脾臟重量明顯大于免疫組小鼠脾臟、免疫組DNA擴(kuò)增陰性，有效抵抗C. abortus的侵襲。這些評(píng)價(jià)指標(biāo)的結(jié)果表明機(jī)體在接種了該疫苗以后，誘導(dǎo)產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答，包括Th1型細(xì)胞免疫應(yīng)答和Th2型體液免