泰山松花粉多糖對(duì)羊綠膿桿菌滅活疫苗的免疫增強(qiáng)作用.pdf

1、隨著我國(guó)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展和人民生活水平的提高，人們對(duì)羊肉需求量的不斷擴(kuò)大，推動(dòng)了我國(guó)養(yǎng)羊業(yè)向規(guī)?；图s化方向發(fā)展。然而隨著養(yǎng)羊產(chǎn)業(yè)的擴(kuò)大，羊發(fā)生傳染病的種類(lèi)也不斷地增加。其中呼吸道疾病給羊群的健康帶來(lái)很大的威脅，綠膿桿菌作為一種條件性致病菌，感染羊群后發(fā)生慢性化膿性肺炎，造成羊群呼吸困難、咳嗽、流膿性鼻液等，嚴(yán)重的可以導(dǎo)致羊只死亡，給養(yǎng)羊業(yè)帶來(lái)很大的經(jīng)濟(jì)損失。同時(shí)綠膿桿菌病作為一種人畜共患病對(duì)人類(lèi)的健康也帶來(lái)很大的威脅。由此可見(jiàn)，對(duì)綠膿桿菌

2、的防治顯得尤為重要。
　　目前檢測(cè)綠膿桿菌多采用傳統(tǒng)的細(xì)菌分離鑒定方法，主要包括細(xì)菌的分離培養(yǎng)、生化鑒定、藥敏試驗(yàn)、致病性試驗(yàn)等。隨著分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展與應(yīng)用，綠膿桿菌的PCR檢測(cè)方法也被廣泛地應(yīng)用。綜合這些方法可以準(zhǔn)確的對(duì)該菌進(jìn)行鑒定。養(yǎng)殖場(chǎng)中對(duì)綠膿桿菌病的防控多采用加入白油等傳統(tǒng)佐劑制備的滅活疫苗，但是此類(lèi)疫苗存在局部產(chǎn)生非細(xì)菌性炎癥、肉芽腫及降低生產(chǎn)性能等副作用。疫苗中是否可以加入更加安全、高效、綠色的佐劑成為本研究的

3、主要方面。本實(shí)驗(yàn)室前期已經(jīng)證明松花粉多糖作為免疫佐劑可以增強(qiáng)動(dòng)物機(jī)體的免疫功能。因此，本課題從發(fā)病羊場(chǎng)分離羊綠膿桿菌，并且制備得到了加入泰山松花粉多糖的羊綠膿桿菌滅活疫苗，研究松花粉多糖對(duì)其滅活疫苗的免疫增強(qiáng)作用，以其為泰山松花粉作為羊綠膿桿菌滅活疫苗的佐劑提供技術(shù)支持和理論依據(jù)。
　　本研究分為兩部分:
　　1.羊綠膿桿菌的分離與鑒定
　　對(duì)山東省6個(gè)地區(qū)10個(gè)規(guī)?；驁?chǎng)送檢的病、死羊進(jìn)行臨床癥狀觀察、病理學(xué)檢查，對(duì)

4、所分離的菌株進(jìn)行常規(guī)細(xì)菌學(xué)形態(tài)檢測(cè)和16S rRNA基因的分子鑒定。試驗(yàn)結(jié)果顯示，從剖檢病死羊的臟器組織中分離出6株細(xì)菌(分別命名為PA1-PA6)，分離菌株在普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂上長(zhǎng)出淡綠色的菌落，血平板上出現(xiàn)溶血環(huán)。鏡檢顯示均為革蘭氏陰性的短桿菌，藥敏試驗(yàn)表明對(duì)慶大霉素高度敏感，動(dòng)物致病性試驗(yàn)顯示對(duì)小白鼠具有致病性作用。結(jié)合流行病學(xué)等初步判定，分離得到的菌株為綠膿桿菌。16S rRNA序列分析結(jié)果表明，分離的6株菌與NCBI上發(fā)表的綠膿桿菌

5、16S rRNA序列的同源性為99.9-100％，與其中登錄的YMD-4、B136-33以及LCQ-4序列的綠膿桿菌菌株位于同一分支上，屬于一個(gè)亞群，進(jìn)化樹(shù)顯示與從北京地區(qū)分離的B136-33菌株進(jìn)化關(guān)系更近，核苷酸序列同源性為100％。該試驗(yàn)為羊場(chǎng)綠膿桿菌病的診斷和治療提供了依據(jù)。
　　2.泰山松花粉多糖對(duì)羊綠膿桿菌滅活疫苗免疫增強(qiáng)作用的研究
　　選取從山東省規(guī)模化羊場(chǎng)中分離得到具有較強(qiáng)致病性的羊綠膿桿菌PA2株，培養(yǎng)、滅

6、活制備得到羊綠膿桿菌滅活菌液。通過(guò)水提醇沉法提取泰山松花粉多糖，在羊綠膿桿菌滅活菌液中加入不同濃度泰山松花粉多糖，制備羊綠膿桿菌泰山松花粉多糖滅活疫苗。免疫健康的Balb/c小鼠來(lái)研究泰山松花粉多糖對(duì)注射羊綠膿桿菌滅活疫苗小鼠的免疫增強(qiáng)功能。試驗(yàn)結(jié)果顯示:泰山松花粉多糖組能提高小鼠的抗體水平、T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率、外周血CD4+和CD8+的含量及IL-2的水平。其中松花粉多糖（多糖mg/體重g）在0.4mg/g時(shí)免疫效果最佳。在0.2mg/