CD137L在結(jié)直腸癌腫瘤組織的表達及其生物學(xué)功能的研究.pdf

1、背景與目的
　　 結(jié)直腸癌(colorectal cancer,CRC)是我國常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一,近年來隨著人民生活水平提高和社會結(jié)構(gòu)老齡化傾向,其發(fā)病率有增高趨勢。結(jié)直腸癌侵襲轉(zhuǎn)移的發(fā)生是導(dǎo)致患者死亡的主要因為。多年來為了探討其發(fā)病機制、早期診斷和有效的治療方法,人們進行了大量的研究,取得了一定的進展。但其發(fā)病因為尚未完全清楚。
　　 研究發(fā)現(xiàn)CD137L可組成性表達于Raji、Daudi、Colo 205、H

2、CT 116、HT29、LX 1、PC 3、SKBR細胞及人體腫瘤組織細胞。腫瘤細胞株表面的CD137L具有一定的生物學(xué)功能,應(yīng)用固定化的CD137活化CD137L,能促進腫瘤細胞分泌IL-8。HCT 116、HT 29與T細胞在加入CD3單抗的培養(yǎng)基中共同培養(yǎng)時,能顯著促進T細胞分泌IFN-γ,并且IFN-γ的分泌量與腫瘤細胞的數(shù)量及細胞表面CD137L的表達水平呈正相關(guān)。人T細胞白血病細胞株CEM及人B細胞系淋巴瘤細胞株Raji細胞

3、表面表達CD137及CD137L,體外實驗發(fā)現(xiàn)通過激活其表面的CD137L或CD137能夠促進細胞增殖、降低細胞凋亡、減弱抗癌藥物的細胞毒效應(yīng)。最近一項研究運用冰凍免疫組化技術(shù)檢測了36例惡性腫瘤原發(fā)灶中CD137及CD137L的表達情況,發(fā)現(xiàn)15例CD137的表達為陽性(染色細胞數(shù)大于10％),21例CD137L的表達為陽性；其中16例中低分化的腫瘤組織,11例CD137的表達為陽性,12例CD137L,的表達為陽性。并且,CD137

4、表達于腫瘤組織血管平滑肌細胞及內(nèi)皮細胞表面,CD137L表達于腫瘤細胞表面。而在15例人體良性腫瘤組織中,僅2例檢測出CD137的陽性表達,3例檢測出CD137L的陽性表達,在12例正常組織中均未能檢測出這兩個分子的表達。
　　 CD137L從細胞表面清除的過程中釋放出可溶性CD137L(soluble CD137L,sCD137L),其釋放過程可以被基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑(matrix metalloproteinaseinhi

5、bitor,MMPI)阻斷。Salih等發(fā)現(xiàn)sCD137L在健康人的血清中的表達水平很低(3.2pg/ml),而在惡性血液病患者血清中sCD137L濃度顯著升高,31例非何杰金氏淋巴瘤(non-Hodgkin lymphoma,NHL)、52例骨髓增生異常綜合癥(myelodysplastic syndrome,MDS)、20例急性髓細胞性白血病(acute myeloicleukemia,AML)患者血清sCD137L的平均值分別為5

6、7 pg/ml、210 pg/ml、682pg/ml。高濃度的sCD137L可能通過與膜表面CD137L競爭結(jié)合位點,從而抑制了免疫細胞與抗原呈遞細胞之間共刺激活化信號的轉(zhuǎn)導(dǎo),使機體的細胞免疫應(yīng)答功能受損,同時也減弱了腫瘤細胞膜表面CD137L的信號傳導(dǎo),可能有助于腫瘤細胞逃逸機體免疫系統(tǒng)的監(jiān)視。高濃度的sCD137L隨循環(huán)到達遠端的組織器官,也可能是這些惡性血液病某些病理生理變化的因為之一。進一步研究發(fā)現(xiàn)血清sCD137L的濃度與疾病

7、的轉(zhuǎn)歸有一定關(guān)系,血清sCD137L高濃度與MDS的迅速進展有關(guān),而血清sCD137L濃度低的患者無進展生存時間較長。對42例AML患者的研究發(fā)現(xiàn),M1/M2型AML患者血清sCD137L濃度均值為1470 pg/ml,明顯高于M4/M5型AML(89 pg/ml),并且濃度低的患者治療后較易取得完全緩解。
　　 一般認為在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中,腫瘤細胞通常低表達或不表達共刺激分子從而逃避機體免疫系統(tǒng)的識別。人結(jié)腸癌細胞株Col

8、o 205、HT 29、HCT 116以及多種腫瘤組織細胞表面均表達CD137L,并且該分子具有的生物學(xué)活性,能促使腫瘤細胞增殖、分泌IL-8,降低細胞凋亡,減弱抗癌藥物的細胞毒效應(yīng)。CD137L表達于多種人體腫瘤組織細胞表面,CD137則表達于腫瘤組織血管壁,因此我們推測CD137/CD137L這一對共刺激分子在腫瘤微環(huán)境中發(fā)揮一定作用,通過雙向信號轉(zhuǎn)導(dǎo)對腫瘤的發(fā)生、進展及轉(zhuǎn)移町能具有特殊的生物學(xué)意義。我們運用實時熒光定量RT-PCR

9、及冰凍免疫組化法檢測結(jié)直腸癌組織CD137L的表達,探討這兩項指標與各臨床病理因素之間的關(guān)聯(lián)性,揭示CD137L在結(jié)直腸癌發(fā)展中的可能作用,為尋找結(jié)腸癌新的分子標志物及治療靶點奠定基礎(chǔ)；運用固定化CD137/Fc刺激CD137L高表達結(jié)腸癌細胞株Colo 205,然后運用CCK-8檢測細胞增殖,EIASA法檢測培養(yǎng)上清中IL-8的濃度,Transwell實驗檢測細胞體外侵襲力,明膠酶譜法分析培養(yǎng)上清中MMP-9的含量,Westernbl

10、otting分析Akt、phospho-Akt、p38、phospho-p38、ERK及phospho-ERK的表達,進一步揭示CD137L對腫瘤細胞的生物學(xué)作用,初步探討其可能機制。
　　 方法
　　 1.收集2007年10月～2008年4月我院手術(shù)切除的結(jié)直腸痛組織標本54例及距離腫瘤邊緣10cm處癌旁組織標本18例,腫瘤組織經(jīng)病理檢查均為腺癌。54例患者中男性29例,女性25例,年齡22～84歲,中位年齡60歲。結(jié)

11、腸癌38例,直腸癌12例,直腸乙狀結(jié)腸交界癌4例。28例有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。組織切除后30m內(nèi)采集標本,放入凍存管,浸泡在RNAlate(R)中,4℃過夜后,-80℃保存待測,用于實時熒光定量RT-PCR檢測CD137L mRNA的表達。
　　 2.同時切取黃豆大小腫瘤組織及癌旁組織,加少許冰凍切片包埋劑用鋁箔包裹,浸沒于液氮中速凍成塊后置-80℃保存,用于冰凍切片免疫組化檢測CD137L蛋白在結(jié)直腸癌組織及癌旁組織的表達。
　

12、　 3.由2位病理醫(yī)師在不知道任何臨床和病理資料的情況下對免疫組織化學(xué)檢測結(jié)果進行評估。免疫組化結(jié)果判斷采用半定量的方法。染色強度無色為0分,淡黃色為1分,棕黃色為2分,棕褐色為3分。計數(shù)陽性細胞比例,<5％為0分,5～10％為1分,11～50％為2分,>50％為3分。將染色強度得分與陽性細胞得分相乘,0分為“-”,1～2分為“+”,3～-,5分為“++”,6分以上為“+++”。我們將“-～+”定義為蛋白低表達,將“++～+++”定義

13、為蛋白高表達。采用x2檢驗分析CD137L蛋白表達與各臨床參數(shù)之間的關(guān)系。
　　 4.運用流式細胞術(shù)檢測本室保存的結(jié)腸癌細胞株Colo 205細胞表面CD137L的表達。為進一步探討CD137L在結(jié)腸癌組織微環(huán)境中可能發(fā)揮的作用,運用結(jié)腸癌細胞株Colo 205進一步研究CD137L對腫瘤細胞可能發(fā)揮的生物學(xué)作用。
　　 5.Colo 205細胞在未包被、CD137/Fc或IgG1 Fc包被的培養(yǎng)板中培養(yǎng)24h、48h、

14、72h后,運用CCK-8法測定細胞的增殖情況。
　　 6.Colo 205細胞在未包被、CD137/Fc或IgG1 Fc包被的培養(yǎng)板中培養(yǎng)48h后,ELISA法檢測培養(yǎng)上清中IL-8的濃度。
　　 7.Matrigel中分別加入CD137/Fc(終濃度為2μg/ml)或Human IgG1 Fc(終濃度為1μg/ml),然后包被到transwell小室底部膜的上室面。Colo 205細胞加入transwell上室,培養(yǎng)4

15、8h后,將小室取出,輕輕擦去上室內(nèi)未穿過濾膜的細胞,固定染色后,在200倍光鏡下隨機取5個視野計數(shù)穿透細胞,其均值代表侵襲力。
　　 8.Colo 205細胞在未包被、CD137/Fc或IgG1 Fc包被的培養(yǎng)板中培養(yǎng)48h后,明膠酶譜法分析培養(yǎng)上清中MMP-9的含量。
　　 9.Colo 205細胞在未包被、CD137/Fc或IgG1 Fc包被的培養(yǎng)板中培養(yǎng)12h后,Western blotting分析Akt、phos

16、pho-Akt、p38、phospho-p38、ERK及phospho-ERK的表達情況。
　　 結(jié)論
　　 1.CD137L mRNA及蛋白在結(jié)直腸癌腫瘤組織中表達顯著高于癌旁組織,CD137L蛋白表達于結(jié)直腸癌腫瘤細胞表面,且在Dukes C期、Dukes B期的表達最強,Dukes D期次之,Dukes A期最弱,提示該分子可能在結(jié)直腸癌的發(fā)生進展中有特殊的生物學(xué)意義。
　　 2.CD137L蛋白在癌旁組織