結直腸癌中新的細胞亞群NCCC的分離與生物學功能的研究.pdf

1、第一部分 目的:在活細胞內,通過準確而有效的方法,將ki67high和ki67low/-兩個細胞亞群區(qū)別并分選出來,為研究兩者功能提供穩(wěn)定的體系。
　　方法:構建ki67啟動子(-1182~+575)驅動綠色熒光蛋白(GFP)表達的慢病毒系統,包裝病毒后感染腫瘤細胞;將陽性克隆注射于裸鼠皮下,4-6周后處死裸鼠收獲移植瘤,處理成單細胞懸液后用流式細胞儀分選出GFP+和GFPlow/-的細胞,再鑒定其ki67的表達,檢測GFP能否

2、反映ki67內源性表達。
　　結果:成功構建了ki67啟動子驅動GFP表達的慢病毒系統;通過該系統分選的GFP+表達較高的ki67和各種cyclins,GFPlow/-的細胞低或不表達ki67和cyclins。
　　結論:ki67啟動子驅動GFP表達的慢病毒系統能夠有效的分選出ki67+和ki67low/-兩個細胞亞群。
　　第二部分
　　目的:比較ki67low/-和ki67+兩個細胞亞群在成瘤能力,自我更新能

3、力,轉移能力,耐化療能力等腫瘤干細胞相關特性方面的差異。
　　方法:通過第一部分中的方法,將分選得到的ki67low/-(GFPlow/-)和ki67+(GFP+)進行體外的克隆形成試驗(cloneformationassay),連續(xù)成球試驗(serialsphereformationassay)以及體內的有限稀釋試驗(limiteddilutionassay)比較ki67low/-和ki67+兩個細胞亞群在成瘤能力和自我更新能力

4、;通過脾包膜下注射腫瘤細胞觀察肝轉移比較二者轉移能力;通過腹腔注射5-Fu觀察皮下移植瘤的生長,比較二者體內耐化療的能力。
　　結果:ki67low/-(GFPlow/-)較ki67+(GFP+)具有更強的成瘤和自我更新能力;其肝轉移的能力也更明顯;對5-Fu的不敏感。
　　結論:ki67low/-表現出更顯著的腫瘤干細胞相關特性。
　　第三部分
　　目的:證實ki67low/-細胞在臨床結直腸癌中的存在,探討其

5、與腫瘤的病理即病人預后的關系。
　　方法:收集2005年胃腸外科所有stageIII的結直腸癌原位腫瘤標本,免疫組化染色ki67并統計其表達,收集相關臨床信息,追訪病人生存時間,揭示ki67的表達與腫瘤病理和病人預后的關系。
　　結果:臨床結直腸癌中確實存在ki67表達異質性的細胞;在stageIII的結直腸癌中,ki67表達與病人的性別,年齡和腫瘤性質無關,低表達ki67的腫瘤分化越差,發(fā)生轉移可能性越高,低表達ki67的