黃傘中抗氧化成分的分離鑒定及其抗HIV-1作用機(jī)制研究.pdf

1、大型真菌作為天然活性成分的重要來(lái)源，其代謝產(chǎn)物種類豐富，具有多種獨(dú)特的化學(xué)結(jié)構(gòu)和生理活性。本實(shí)驗(yàn)以食用真菌為研究對(duì)象，圍繞其抗氧化活性成分的分離純化，抗HIV-1和免疫調(diào)節(jié)活性以及相關(guān)作用機(jī)制進(jìn)行研究。
　　本研究首先利用紅細(xì)胞溶血和脂質(zhì)過(guò)氧化抑制實(shí)驗(yàn)，對(duì)64株大型真菌的粗提物進(jìn)行了抗氧化活性測(cè)定，確定以黃傘（Pholiota adiposa）子實(shí)體作為研究對(duì)象。然后利用乙醇提取、乙酸乙酯萃取、NKA大孔吸附樹(shù)脂、Sephadex

2、 G-15和Sephadex LH-20分子篩凝膠層析以及高效液相色譜(HPLC)等層析方法，首次從黃傘中分離純化得到三個(gè)小分子活性成分PB3、HEB和PC3-3。通過(guò)定性試驗(yàn)、質(zhì)譜、紅外光譜以及與相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)品HPLC保留時(shí)間的比對(duì)，確定第一個(gè)成分為腺苷(adenosine，C10H13N5O4，PB3)，第二個(gè)成分為沒(méi)食子酸甲酯(methylgallate，C8H8O5，HEB)，第三個(gè)成分為甾體皂苷類化合物(PC3-3)。反應(yīng)濃度為2

3、50μg/ml時(shí)，PC3-3和HEB對(duì)紅細(xì)胞氧化溶血的抑制率為26.9％和82.4％，抑制脂質(zhì)過(guò)氧化率達(dá)88.2％和17.3％，PC3-3和HEB分別在不同的體外檢測(cè)體系中顯示出極強(qiáng)的抗氧化活性。此外，HEB對(duì)超氧陰離子和DPPH自由基都具有較強(qiáng)的清除活性，250μg/ml濃度下清除率分別達(dá)到71.4％和85.6％。
　　為了大規(guī)模篩選具有胞內(nèi)抗氧化活性的化合物，本實(shí)驗(yàn)將具有氧化還原敏感性質(zhì)的綠色熒光蛋白（croGFP）基因在大腸

4、桿菌中進(jìn)行表達(dá)，構(gòu)建了能夠通過(guò)GFP熒光強(qiáng)度水平定量表征細(xì)菌胞內(nèi)氧化還原水平的檢測(cè)模型。鑒于抗氧化與抗HIV-1之間的密切關(guān)系，進(jìn)一步將croGFP基因在HIV-1病毒宿主細(xì)胞系TZM-BL中進(jìn)行表達(dá)，TZM-BL細(xì)胞基因組內(nèi)整合了HIV-LTR調(diào)控的熒光素酶基因luc序列，從而得到了通過(guò)GFP熒光強(qiáng)度表征胞內(nèi)氧化還原水平、熒光素酶活性表征病毒LTR.激活水平的抗氧化、抗HIV-1細(xì)胞檢測(cè)模型。利用大腸桿菌胞內(nèi)抗氧化篩選模型(E.col

5、i-croGFP)，對(duì)具有體外抗氧化活性的真菌提取物進(jìn)行再次檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，僅有包括黃傘、紅菇、NK2100、猴頭、褐孔菌和早北c滑在內(nèi)的六種食用菌菌絲浸提物能夠顯示一定的胞內(nèi)抗氧化活性，證明體外抗氧化成分并不一定能夠進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮活性。利用抗氧化、抗HIV-1細(xì)胞檢測(cè)模型(TZM-BL-croGFP)，通過(guò)流式細(xì)胞儀和發(fā)光檢測(cè)儀對(duì)細(xì)胞內(nèi)的GFP熒光強(qiáng)度和Luc酶活性進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，活性氧刺激使細(xì)胞內(nèi)氧化還原水平升高會(huì)直接激活HIV-1啟動(dòng)子L

6、TR調(diào)控的下游基因表達(dá)，證實(shí)了氧化應(yīng)激與HIV-LTR轉(zhuǎn)錄激活之間的直接關(guān)系。HEB能夠有效地抑制雙氧水誘導(dǎo)的胞內(nèi)氧化應(yīng)激，抑制率IC50達(dá)26.0μM;并且抑制了由于細(xì)胞內(nèi)氧化水平升高引起的HIV-LTR激活，能夠?qū)?00μMH2O2刺激指示細(xì)胞系產(chǎn)生的信號(hào)從18.2％降低到2％左右;HEB還能夠抑制HIV-1假病毒感染TZM-BL細(xì)胞的復(fù)制增殖，其抑制率IC50達(dá)到11.9μM，證明了抗氧化劑HEB具有抗HIV-1活性。這兩個(gè)胞內(nèi)檢

7、測(cè)模型具有接近生理狀態(tài)、成本低、操作簡(jiǎn)單快速、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，適合用于抗氧化、抗HIV-1活性成分的大規(guī)模篩選。
　　為進(jìn)一步對(duì)HEB的抗氧化、抗HIV-1作用機(jī)制進(jìn)行研究，本實(shí)驗(yàn)利用Westernblot對(duì)細(xì)胞內(nèi)核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB活化情況進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，H2O2能夠激活細(xì)胞內(nèi)NF-κB活化，促進(jìn)阻遏蛋白IκB降解，使NF-κB與IκB解離并進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)行使功能。天然抗氧化成分HEB能夠有效抑制NF-κB的活化入核，并防止IκB降

8、解，從而抑制H2O2引起的氧化應(yīng)激導(dǎo)致的NF-κB信號(hào)途徑活化，阻止NF-κB與HIV-1啟動(dòng)子LTR上的κB靶序列結(jié)合，抑制病毒復(fù)制轉(zhuǎn)錄。
　　本研究發(fā)現(xiàn)，抗氧化成分HEB具有生物多效性，能夠通過(guò)多個(gè)靶點(diǎn)抑制HIV-1病毒復(fù)制。與病毒感染2h完成進(jìn)入過(guò)程后給藥相比，HEB預(yù)保護(hù)能夠更好地抑制HIV-LTR激活，證明HEB對(duì)病毒感染的進(jìn)入過(guò)程具有一定的抑制作用，但又不僅限于此。進(jìn)一步利用實(shí)驗(yàn)室已有的HIV-1三大關(guān)鍵酶活性檢測(cè)體系

9、進(jìn)行實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，抗氧化劑HEB對(duì)HIV-1逆轉(zhuǎn)錄酶和整合酶活性都有不同程度的抑制作用，抑制率IC50分別達(dá)到80.1μM和228.5μM，并且在200μM濃度下對(duì)HIV-1蛋白酶的抑制率也達(dá)到17％左右。所以HEB對(duì)HIV-1生長(zhǎng)周期中包括病毒進(jìn)入、逆轉(zhuǎn)錄、整合和成熟蛋白加工在內(nèi)的多個(gè)過(guò)程產(chǎn)生影響。
　　細(xì)胞因子在免疫系統(tǒng)中作用十分重要，黃傘中的活性成分能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄。通過(guò)小鼠腹腔給藥體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)脾細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞

10、因子的mRNA變化情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)HEB能夠顯著提高IFN-γ的表達(dá)到兩倍以上，同時(shí)下調(diào)Th2型細(xì)胞因子IL-4和IL-10的表達(dá)至50％左右，有利于調(diào)節(jié)艾滋病患者體內(nèi)Th1/Th2型細(xì)胞因子失衡的狀態(tài)。而PB3則通過(guò)提高細(xì)胞因子合成抑制因子IL-10的表達(dá)至約1.5倍，以及不同程度的下調(diào)包括IL-2、IFN-γ、IL-4和IL-6在內(nèi)的多種細(xì)胞因子的表達(dá)，體現(xiàn)出較強(qiáng)的抗炎癥作用。
　　綜上所述，本研究從抗氧化、抗HIV-1和免疫調(diào)