SDF-1對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞在大鼠脊髓損傷恢復(fù)中作用的影響.pdf

1、背景和目的：
　　基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1(stromalcell-derived factor1，SDF-1)屬CXC趨化因子亞家族，最初從骨髓基質(zhì)細(xì)胞中克隆發(fā)現(xiàn)，是一類(lèi)對(duì)某些細(xì)胞具有趨化作用的分泌型多肽。SDF-1在體內(nèi)通過(guò)與趨化因子受體結(jié)合參與調(diào)節(jié)體內(nèi)多種生理或病理過(guò)程，特別是與中樞神經(jīng)損傷后的炎癥反應(yīng)、各種內(nèi)源性干細(xì)胞向病灶部位的募集及局部新生血管的形成有密切關(guān)系。本研究主要通過(guò)體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)來(lái)觀察SDF-1是否影響神經(jīng)干細(xì)胞的遷

2、移，進(jìn)而影響脊髓損傷后大鼠下肢功能恢復(fù)。
　　資料與方法：
　　1.神經(jīng)干細(xì)胞的提取、培養(yǎng)、鑒定及細(xì)胞熒光標(biāo)記:通過(guò)解剖新生SD(Sprague-Dawley)大鼠獲得大腦組織，利用無(wú)血清神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)，獲取神經(jīng)干細(xì)胞，并觀察其增殖分化，然后應(yīng)用免疫熒光法鑒定神經(jīng)球表面巢蛋白和Westernblot鑒定CXCR4蛋白的表達(dá)，使用CM-Dil對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記。
　　2.實(shí)驗(yàn)分組:體外Transwell遷移實(shí)

3、驗(yàn)中，根據(jù)不同濃度的培養(yǎng)條件將實(shí)驗(yàn)分為4組:①對(duì)照組（下室不加SDF-1，神經(jīng)干細(xì)胞不經(jīng)AMD3100孵育）;②AMD3100組（下室不加SDF-1，神經(jīng)干細(xì)胞經(jīng)AMD3100孵育）;③SDF-1+AMD3100組（下室加SDF-1，神經(jīng)干細(xì)胞經(jīng)AMD3100孵育）;④SDF-1組（下室加SDF-1，神經(jīng)干細(xì)胞不經(jīng)AMD3100孵育）。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中將72只成年雌性SD大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為4組:①空白對(duì)照組（不移植神經(jīng)干細(xì)胞）;②神經(jīng)干細(xì)

4、胞移植組;③神經(jīng)干細(xì)胞聯(lián)合SDF-1移植組;④AMD3100孵育神經(jīng)干細(xì)胞移植組。
　　3.大鼠脊髓損傷模型的制作、細(xì)胞移植及標(biāo)本制作:應(yīng)用自制改良Allen's打擊器制備大鼠脊髓損傷模型，在造模成功7天時(shí)通過(guò)尾靜脈進(jìn)行神經(jīng)干細(xì)胞移植。在大鼠損傷后的1、7、14、21、28天，分別對(duì)各組脊髓損傷大鼠進(jìn)行BBB(Basso-Beattie-Bresnahan)后肢功能評(píng)定，隨后處死大鼠，取出脊髓標(biāo)本進(jìn)行冰凍切片，觀察脊髓局部熒光及病

5、理HE染色結(jié)果。
　　4.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（(x)±S）表示，統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)專(zhuān)業(yè)軟件包進(jìn)行處理，采用單因素方差分析(analysis of variance ，ANOVA)進(jìn)行多組之間定量資料比較，各組間的兩兩比較使用S-N-K(Student-Newman-Keulstest，S-N-K)檢驗(yàn)，P＜0.05時(shí)認(rèn)為結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　結(jié)果：
　　1.從新生SD大鼠腦組織中經(jīng)分離

6、、培養(yǎng)得到的神經(jīng)干細(xì)胞能形成神經(jīng)球，細(xì)胞免疫熒光鑒定細(xì)胞巢蛋白表達(dá)陽(yáng)性，且SDF-1相應(yīng)受體CXCR4在神經(jīng)干細(xì)胞表面表達(dá)陽(yáng)性。
　　2.在體外Transwell遷移實(shí)驗(yàn)中，隨著SDF-1濃度梯度增加(50～200ng/ml)，下室神經(jīng)干細(xì)胞遷移數(shù)目不斷增加，說(shuō)明遷移細(xì)胞數(shù)量和SDF-1濃度呈正相關(guān)，與對(duì)照組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，而在200ng/ml與250ng/ml時(shí)，兩組遷移量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）

7、;CXCR4的阻斷劑AMD3100能明顯抑制SDF-1趨化遷移效果，與對(duì)照組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　3.在大鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，單獨(dú)神經(jīng)干細(xì)胞移植組和神經(jīng)干細(xì)胞與SDF-1聯(lián)合移植組大鼠脊髓損傷區(qū)均能見(jiàn)到熒光標(biāo)記細(xì)胞聚集，HE染色結(jié)果未見(jiàn)明顯空洞形成，且脊髓損傷大鼠BBB評(píng)分明顯提高，在細(xì)胞移植后的7、14、21天與其他兩組相比BBB評(píng)分差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，且聯(lián)合治療組評(píng)分優(yōu)于單獨(dú)神經(jīng)干細(xì)胞治療組，差

8、異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）;AMD3100孵育神經(jīng)干細(xì)胞移植組，脊髓損傷大鼠功能未見(jiàn)明顯改善，與對(duì)照組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。
　　結(jié)論：
　　1.從新生大鼠腦組織提取神經(jīng)干細(xì)胞過(guò)程簡(jiǎn)單，技術(shù)便于掌握;細(xì)胞培養(yǎng)所需時(shí)間短，可保證短間內(nèi)得到足量細(xì)胞，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)開(kāi)展奠定了基礎(chǔ)。
　　2.神經(jīng)干細(xì)胞表面能表達(dá)SDF-1趨化因子受體CXCR4。
　　3.SDF-1對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞的趨化遷移效應(yīng)具有明顯的濃度