外源性VEGF對腦缺血模型大鼠認知能力的保護作用及機制探究.pdf

1、目的:
　　(1)通過在體(in vivo)實驗觀察外源性血管內皮生長因子VEGF對慢性低灌注型腦缺血模型大鼠認知功能的保護作用及電生理學和組織學機制。
　　(2)利用離體（in vitro）海馬腦片缺血缺氧模型探討VEGF對海馬神經元保護作用的細胞學及電生理學機制。
　　方法:
　　(1)In vivo:將30只雄性Wistar大鼠隨機分成3組，每組10只:假手術組（Sham）、缺血組(Ischemia)、VE

2、GF處理組(Ischemia+VEGF)。采用雙側頸總動脈結扎(2-VO)2周建立慢性低灌注型腦缺血大鼠模型。采用鼻飼法給予外源性VEGF，然后利用Morris水迷宮實驗(MWM)比較各組大鼠的空間認知功能;行為學實驗后，進行電生理實驗，內容包括海馬CA3-CA1區(qū)的長時程增強LTP以及局部場電位(LFP)，并應用神經信息流算法分析各組大鼠CA3與CA1區(qū)神經網絡的振蕩模態(tài)的變化。實驗結束后取腦，使用ELISA的方法測定各組海馬內VEG

3、F的含量并通過組織學方法(HE染色)觀察海馬CA1區(qū)錐體細胞的形態(tài)結構。
　　(2) In vitro:首先利用糖氧剝奪(OGD)的方法建立離體缺血缺氧海馬腦片模型，實驗分為4組，即正常組(Control)、糖氧剝奪組(OGD)、VEGF處理組(OGD+VEGF)、VEGF及其受體抑制劑處理組(OGD+VEGF+SU5416)。使用碘化丙啶(PI)染色的方法并利用共聚焦顯微鏡觀察各組腦片海馬CA1區(qū)神經元在OGD處理20 min后

4、的存活情況。然后分別記錄各組腦片在OGD處理10 min以及恢復正常腦脊液后的電生理信號的變化，包括神經元膜電位、自發(fā)放電頻率以及sEPSCs的變化。
　　結果:
　　(1)水迷宮(MWM)實驗結果發(fā)現，缺血組大鼠的逃避潛伏期從訓練的第3天開始比假手術組顯著延長(Ischemia:13.5±1.9svs.Sham:8.1±1.2 s，P＜0.05)，而VEGF處理后的腦缺血大鼠的逃避潛伏期也從第3天開始比缺血組大鼠明顯地縮短

5、了(Ischemia+VEGF:8.5±1.1s，P＜0.05 vs.Ischemia);但是，三組大鼠的平均游泳速度無顯著性差別(P＞0.05)。測試日的實驗發(fā)現，缺血組大鼠在目標象限停留的百分比比假手術組的大鼠明顯減少（Ischemia:34.2±1.6％ vs.Sham:42.9±1.5％，P＜0.05），VEGF處理后缺血大鼠的目標象限百分比幾乎恢復到假手術組的水平(Ischemia+ VEGF:40.1±2.6％)。
　

6、　(2)記錄并分析各組大鼠海馬CA3-CA1通路的長時程增強LTP的結果發(fā)現，缺血組的場興奮性突觸后電位(fEPSPs)斜率百分比比假手術組顯著降低(Ischemia:117.8±6.23％ vs.Sham:136.2±5.96％，P＜0.01)，而VEGF組則比缺血組明顯要高(130.6±5.36％，P＜0.01 vs.Ischemia)。
　　(3)記錄并計算各組大鼠海馬CA3與CA1區(qū)局部場電位(LFP)的結果發(fā)現，腦缺血能

7、夠引起海馬CA3與CA1腦區(qū)間的相位同步性降低，CA3區(qū)theta相位調控CA1低頻gamma(LG,30-60Hz)幅值的程度顯著降低，而加入VEGF后，CA3、CA1腦區(qū)間的耦合強度均有上升的趨勢。
　　(4) HE染色結果發(fā)現，假手術組大鼠海馬CA1區(qū)錐體神經元形態(tài)正常。而缺血組的CA1神經元排列松散，分布不均，細胞出現水腫以及核固縮的現象。而VEGF處理組大鼠的CA1神經元可見部分形態(tài)正常，部分形態(tài)異常，分布及排列趨近于正

8、常組。
　　(5)分析各組大鼠海馬內VEGF的含量發(fā)現，缺血組大鼠海馬內的VEGF含量明顯比假手術組要低（Sham:745.33±42.34 pg/g vs.Ischemia:420.09±40.82Pg/g，P＜0.01），而VEGF處理組的海馬內的VEGF含量有顯著提高(592.83±38.76 pg/g，P＜0.05 vs.Ischemia)，但仍然低于假手術組（P＜0.05）。
　　(6)在離體實驗中檢測各組腦片海馬

9、CA1神經元存活情況的結果發(fā)現，OGD處理20 min后，神經元的死亡率顯著上升(Control vs.OGD，P＜0.05)，而VEGF孵育組存活細胞的數量增多，接近正常組。然而與VEGFR-2的抑制劑SU5416共孵育之后，神經元的死亡率升高，接近OGD組。
　　(7)膜片鉗實驗發(fā)現，OGD處理后CA1神經元的電生理特性能夠發(fā)生可逆性變化的時間窗口為10 min，在恢復正常aCSF處理后絕大部分神經元的膜電位能夠恢復正常，因此

10、將其確定為本實驗的時間窗口。
　　(8)在10 min OGD處理期間分析各組神經元的興奮性發(fā)現，OGD組神經元的膜電位在OGD結束時去極化了14.7±1.23 mV(n=5)，而VEGF處理組神經元則去極化了6.1±1.57mV(n=8，OGD vs.OGD+VEGF,P＜0.01)。同時共孵育VEGFR-2抑制劑SU5416組(OGD+VEGF+SU5416)則去極化了12.1±1.92 mV(n=6）。同樣的在自發(fā)放電頻率的

11、統(tǒng)計結果中發(fā)現，OGD+VEGF組的神經元的在OGD期間的自發(fā)放電頻率比base時增加了5.1±0.6倍，遠遠低于OGD組（9.2±0.56倍，P＜0.01，n=5），而OGD+VEGF+SU5416放電頻率增加了8.1±0.47倍，高于VEGF處理組且具有顯著差異（P＜0.01，n=5），但是與OGD組相比卻不具有統(tǒng)計學差異(P＞0.05)。
　　(9)在記錄并分析了各組大鼠海馬CA1神經元的sEPSCs事件結果發(fā)現，在10mi

12、n OGD處理期間，各組sEPSCs的幅值和頻率均時間依賴性的增加，而在VEGF處理組，這兩個指標增加的程度被緩解，但仍不能恢復到正常水平。而加入VEGF受體抑制劑SU5416之后，VEGF的緩解效果被解除，說明VEGF的作用是通過VEGFR-2受體發(fā)揮作用的。
　　結論:
　　(1)外源性給予VEGF可顯著改善VD大鼠的空間認知障礙，其機制包括改善缺血大鼠海馬錐體神經元水腫和核固縮情況，維持海馬神經元正常功能。
　　

13、(2)通過鼻飼法給予外源性VEGF是一種可行的方法，可以使缺血大鼠海馬內VEGF的含量有效升高，對缺血產生了保護作用。
　　(3) VEGF能夠改善VD大鼠海馬內突觸可塑性的降低，增強CA3-CA1的長時程增強LTP，這一現象可能與VEGF改善了它們之間theta節(jié)律與gamma節(jié)律的交叉耦合模式有關。
　　(4)在離體缺血缺氧腦片模型中，外源性VEGF能夠通過其VEGFR-2受體來發(fā)揮對海馬神經元的保護作用，其機制是對抗缺