異丙酚對全腦缺血大鼠的神經(jīng)保護作用及其機制探討.pdf

1、腦血管疾病呈逐漸增多的趨勢，成為威脅人類健康的主要疾病之一。另外在神經(jīng)外科手術(shù)、心臟和大血管手術(shù)、老年病人以及危重病人手術(shù)中，如何減少圍術(shù)期腦血管并發(fā)癥已經(jīng)成為臨床工作中急待解決的問題。異丙酚（2，6-diisopropylphenol）是一種在臨床應(yīng)用廣泛的靜脈麻醉藥，許多研究證明異丙酚具有潛在的神經(jīng)保護作用，但也有一些相反的研究結(jié)論。通過分析可以發(fā)現(xiàn)，在以往這些研究中，動物模型以及異丙酚的給藥劑量、給藥方式都各不相同，也許這是這些研

2、究結(jié)論各異的原因，因此探討異丙酚防治腦缺血性損傷的最有效的給藥劑量、給藥時間及給藥方式對異丙酚的臨床應(yīng)用是很重要的。
　　 在探究異丙酚神經(jīng)保護作用的機制時，其對腦缺血時谷氨酸的興奮毒性影響得到了廣泛的關(guān)注。谷氨酸是腦內(nèi)最主要的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，中樞神經(jīng)創(chuàng)傷或缺血可引起谷氨酸的大量地釋放和膠質(zhì)細胞對谷氨酸再攝取能力的降低，造成谷氨酸在細胞外的堆積。谷氨酸與突觸后膜上特異的受體，可以造成鈣通道開放，鈣內(nèi)流增加和鈣超載，是腦缺血、缺氧

3、、癲病發(fā)作、腦外傷和其他許多神經(jīng)疾病神經(jīng)元變性死亡的共同原因和神經(jīng)元死亡的“最后通路”。異丙酚作為一種有效的神經(jīng)保護藥物，對以上病理生理各個環(huán)節(jié)的作用也得到了廣泛的研究。很多研究表明異丙酚可以通過降低谷氨酸的釋放，增加膠質(zhì)細胞對谷氨酸的攝取，最終降低細胞外谷氨酸的濃度。但是異丙酚對腦缺血大鼠海馬神經(jīng)細胞谷氨酸受體數(shù)量和親和力的影響還未見報道。
　　 另外，在以往的谷氨酸攝取方面的研究中，多采用離體實驗的方法，即在體外培養(yǎng)神經(jīng)細胞

4、或神經(jīng)膠質(zhì)細胞，將異丙酚加入細胞培養(yǎng)液中，觀察在各種條件下（如氧糖剝奪以模擬活體動物的腦缺血）神經(jīng)細胞或神經(jīng)膠質(zhì)細胞對培養(yǎng)液內(nèi)放射性標(biāo)記的谷氨酸的攝取情況。這類實驗得出的數(shù)據(jù)可靠性強，卻很難模擬動物在活體狀態(tài)下異丙酚對全腦缺血大鼠海馬神經(jīng)細胞谷氨酸攝取的影響。
　　 因此本研究首先觀察了不同劑量、不同給藥時間及不同給藥方式的異丙酚對大鼠全腦缺血造成的海馬CA1區(qū)的錐體神經(jīng)元遲發(fā)性死亡的影響，為臨床應(yīng)用提供有價值的參考。在此基礎(chǔ)上

5、，應(yīng)用放射性配基結(jié)合法，觀察了異丙酚對全腦缺血大鼠海馬谷氨酸受體數(shù)量和受體親和力、以及谷氨酸攝取的影響，為闡明異丙酚的神經(jīng)保護機制提供依據(jù)。
　　 1.異丙酚對全腦缺血大鼠海馬CA1區(qū)錐體神經(jīng)元的保護作用
　　 采用四血管閉塞法建立大鼠的全腦缺血模型，觀察不同劑量、不同給藥時間及不同給藥方式的異丙酚對大鼠全腦缺血造成的海馬CA1區(qū)的錐體神經(jīng)元遲發(fā)性死亡的影響。
　　 方法：將80只雄性Wistar大鼠隨機分為以下

6、各組（每組5只動物）：
　　 ① sham組：大鼠僅僅接受假手術(shù)，不凝閉椎動脈也不遭受全腦缺血打擊。
　　 ②腦缺血組：永久凝閉雙側(cè)椎動脈，48h后閉塞雙側(cè)頸總動脈8min致全腦缺血。
　　 ③異丙酚預(yù)處理組：在腦缺血前給予異丙酚。按照給藥劑量、給藥時間點和給藥方式的不同，進一步分為預(yù)處理-1至預(yù)處理-8八個亞組（詳見表1）
　　 ④異丙酚治療組：在腦缺血后給予異丙酚。按照給藥劑量、給藥時間點和給藥方式的

7、不同，進一步分為治療-1至治療-6六個亞組。
　　 全腦缺血后第七天，將大鼠斷頭處死，常規(guī)腦組織切片（6μm），硫堇染色。在光鏡下觀察海馬CA1區(qū)DND情況，確定組織學(xué)分級（HG：0級：無神經(jīng)元死亡；Ⅰ級：散在的神經(jīng)元死亡；Ⅱ級：成片的神經(jīng)元死亡；Ⅲ級：幾乎全部的神經(jīng)元死亡）和神經(jīng)元密度（ND：計數(shù)海馬CA1區(qū)每1mm區(qū)段內(nèi)細胞膜完整、胞核飽滿、核仁清晰的錐體細胞數(shù)目，每張切片雙側(cè)海馬各計數(shù)6個區(qū)段，取平均數(shù)為神經(jīng)元密度）。

8、r>　　 結(jié)果：在假手術(shù)組中，海馬CA1區(qū)的錐體細胞為2-3層，排列整齊，細胞膜完整，細胞核及核仁完整清晰。所有動物的HG均為0級，ND為184.5±11.1。而在全腦缺血組，海馬CA1區(qū)的錐體細胞幾乎全部死亡，與假手術(shù)組相比HG顯著增高，而ND則顯著降低。在異丙酚預(yù)處理2至4組（藥物劑量逐步增大），海馬CA1區(qū)大部分錐體細胞存活。與全腦缺血組相比，HG顯著降低，ND顯著增高，而且這種變化呈劑量依賴性。在異丙酚預(yù)處理-1組（藥物劑量最

9、小，40mg.kg-1），大部分錐體細胞死亡，與全腦缺血組相比HG和ND無顯著差異。在預(yù)處理-5組（給藥時間提前到腦缺血前24h），多數(shù)錐體細胞存活，與缺血組相比HG顯著降低，而ND顯著增高。但對錐體細胞的保護作用不及預(yù)處理-4組。在預(yù)處理-6組（間斷靜脈推注）和預(yù)處理-7組（單次腹腔注射），異丙酚對錐體細胞也具有一定程度的保護作用，但其保護作用都不及預(yù)處理-4組。在預(yù)處理-8組（每天靜脈推注20mg.kg-1，連續(xù)5天），海馬CA1區(qū)

10、的錐體細胞幾乎全部死亡，與腦缺血組相比HG和ND均沒有顯著差異。
　　 以上表明，在全腦缺血之前或之后，盡量靠近缺血時間點，采用首次劑量靜脈推注、剩余劑量由微量泵持續(xù)靜脈泵注的給藥方式，給予麻醉劑量（>40mg.kg-1）的異丙酚可發(fā)揮較好的神經(jīng)元保護作用。
　　 2.異丙酚降低全腦缺血大鼠海馬CA1區(qū)谷氨酸受體的數(shù)量和親和力
　　 采用放射性配基結(jié)合法，觀察異丙酚對腦缺血大鼠海馬CA1區(qū)谷氨酸受體的數(shù)量和親和力

11、的影響，探討異丙酚神經(jīng)元保護的機制。
　　 方法：將60只健康雄性Wistar大鼠隨機分為以下4組：
　　 ① sham組（n=6）：大鼠僅僅接受假手術(shù)，不凝閉椎動脈也不遭受全腦缺血打擊。
　　 ②腦缺血組（n=18）：永久凝閉雙側(cè)椎動脈，48h后閉塞雙側(cè)頸總動脈8min致全腦缺血。
　　 ③異丙酚對照組（n=18）：大鼠僅僅接受假手術(shù)，而不遭受全腦缺血打擊，在取材前持續(xù)靜脈輸注90mg.kg-1異丙酚1

12、h。
　　 ④異丙酚+腦缺血組（n=18）：大鼠在遭受8min全腦缺血打擊前3h，持續(xù)靜脈輸注90mg.kg-1異丙酚1h。
　　 腦缺血組、和異丙酚+腦缺血組大鼠于腦缺血再灌注后0h、1h和3h取材，每個時間點5只動物。為與上述時間點相對應(yīng)，sham組于sham手術(shù)后48h、異丙酚對照組于sham手術(shù)后48h、49h和5lh取材。采用放射性配基結(jié)合法測定谷氨酸受體數(shù)量（Bmax值）和親和力（Kd值）。Bmax值越大，谷

13、氨酸受體的數(shù)量越多；Kd值越小，受體的親和力越高。
　　 結(jié)果：腦缺血組大鼠海馬CA1區(qū)谷氨酸受體的Bmax值隨著時間的推移逐步增高。在腦缺血后即刻（0h）為1933.94±336.30fmol/mg protein，與sham組相比無顯著差異，但在腦缺血再灌注后1h，Bmax值上升至2543.64±374.12fmol/mg protein，3h時則上升至3260.61±590.85 fmol/mgprotein，與sham組

14、相比均顯著增高。與sham組和同時間點的腦缺血組相比，異丙酚+腦缺血組、和異丙酚對照組的Bmax值在腦缺血再灌注后即刻（Oh）及1h及相對應(yīng)的時間點（異丙酚對照組）均顯著降低。至腦缺血再灌注后3h及相對應(yīng)的時間點（異丙酚對照組），Bmax值逐漸升高接近sham組水平，但仍低于腦缺血組。
　　 以上研果表明，異丙酚可降低全腦缺血打擊引起的大鼠海馬谷氨酸受體數(shù)量的增加，并降低大鼠海馬谷氨酸受體的親和力。
　　 3.異丙酚增強

15、全腦缺血大鼠海馬CA1區(qū)對谷氨酸的攝取
　　 觀察異丙酚對腦缺血大鼠海馬CA1區(qū)對[3H]-谷氨酸攝取的影響，探討異丙酚神經(jīng)元保護的機制。
　　 方法：將50只健康雄性Wistar大鼠隨機分為以下4組：
　　 ① sham組（n=5）：大鼠僅僅接受假手術(shù)，不凝閉椎動脈也不遭受全腦缺血打擊。
　　 ②腦缺血組（n=15）：永久凝閉雙側(cè)椎動脈，48h后閉塞雙側(cè)頸總動脈8min致全腦缺血。
　　 ③異丙

16、酚對照組（n=15）：大鼠僅僅接受假手術(shù)，而不遭受全腦缺血打擊，并在取材前持續(xù)輸注90mg.kg-1異丙酚1h。
　　 ④異丙酚+腦缺血組（n=15）：大鼠在遭受8min全腦缺血打擊前3h，持續(xù)輸注90mg.kg-1異丙酚1h。
　　 腦缺血組和異丙酚+腦缺血組大鼠于腦缺血再灌注后0h、1h和3h取材，每個時間點5只動物。為與上述時間點相對應(yīng)，sham組于sham手術(shù)后48h、異丙酚對照組于sham手術(shù)后48h、49h和

17、51h取材。用[3H]-谷氨酸測定海馬細胞對谷氨酸的攝取。谷氨酸攝取量=總攝取-非特異攝取。
　　 結(jié)果：sham組海馬CA1區(qū)對[3H]-谷氨酸的攝取為345.00±70.16cpm/50gg。與sham組相比，全腦缺血組在各個時間點的谷氨酸攝取無顯著變化，表明全腦缺血對海馬CA1區(qū)谷氨酸的攝取無影響。異丙酚處理后，無論是異丙酚對照組、還是異丙酚+腦缺血組的谷氨酸攝取均顯著增加，特別是在缺血再灌注后0h和1h及相對應(yīng)的時間點（

18、異丙酚對照組）；至缺血再灌注后3h及相對應(yīng)的時間點（異丙酚對照組），兩組的谷氨酸攝取基本恢復(fù)至sham水平。
　　 以上表明，異丙酚可顯著增加腦缺血大鼠海馬CA1區(qū)細胞對谷氨酸的攝取。
　　 4.結(jié)論
　　 ①在全腦缺血之前或之后，盡量靠近缺血時間點，采用首次劑量靜脈推注、剩余劑量由微量泵持續(xù)靜脈泵注的給藥方式，給予麻醉劑量（>40mg.kg-1）的異丙酚可發(fā)揮較好的神經(jīng)元保護作用。
　　 ②異丙酚可通過