HBV感染相關(guān)的ADAR1基因功能研究.pdf

1、背景：乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)血源性感染是一個(gè)全球范圍內(nèi)的健康問題，可造成慢性感染和慢性肝病，患者死于肝硬化和肝癌的風(fēng)險(xiǎn)很高。α干擾素(interferonα，IFNα)是臨床治療慢性乙型肝炎的最常用的藥物，可以顯著抑制HBV復(fù)制。研究證實(shí)α干擾素結(jié)合細(xì)胞表面受體，通過一系列信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，激活下游抗病毒蛋白，包括RNA特異性腺苷脫氨酶（adenosine deaminases acting on RNA

2、，ADAR1）、粘病毒抵抗蛋白A GTP酶(myxovirus-resistant GTPase，MxA)等實(shí)現(xiàn)抗病毒作用。關(guān)聯(lián)研究發(fā)現(xiàn)ADAR1基因單核苷酸多態(tài)性(single nucleotidepolymorphisms，SNP)位點(diǎn)與IFN治療多發(fā)性硬化及慢性丙型肝炎療效相關(guān)，本實(shí)驗(yàn)室前期研究也表明，ADAR1 rs4845384可能是IFNα治療慢性乙型肝炎無應(yīng)答的相關(guān)因素，與乙肝病毒e抗原(hepatitis B e ant

3、igen，HBeAg)血清轉(zhuǎn)換和自發(fā)性及干擾素誘導(dǎo)的乙肝病毒表面抗原(hepatitis B surface antigen，HBsAg)清除相關(guān)。
　　ADAR1主要生物學(xué)功能是作為RNA編輯酶催化其底物dsRNA發(fā)生A-to-Ⅰ的脫氨反應(yīng)，轉(zhuǎn)錄時(shí)I被讀為G，而發(fā)生核苷替換;還可利用獨(dú)立于編輯活性的RNA結(jié)合蛋白的功能發(fā)揮作用。研究表明，RNA編輯酶在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要功能，ADAR1的表達(dá)受到機(jī)體內(nèi)源的調(diào)節(jié)因子miRN

4、As的調(diào)控，從而引起腫瘤的惡性化發(fā)展;另外，亦有研究發(fā)現(xiàn)其在不同種類的病毒感染中表現(xiàn)出促進(jìn)病毒感染或抵抗病毒感染的作用。近年來有研究發(fā)現(xiàn)在丙型肝炎病毒感染時(shí)，ADAR1能抑制丙型肝炎病毒復(fù)制影響其活性，具有潛在的抗病毒機(jī)制。目前其在慢性乙肝中的作用報(bào)道很少，其作用和機(jī)制都存在爭議。
　　本研究在前期研究的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步探索ADAR1在HBV感染中的作用機(jī)制，為研究乙肝病毒的感染致病機(jī)制及治療乙肝提供新的基于ADAR1的靶點(diǎn)和策略。

5、
　　方法：在HeLa、SK-HEP-1、QGY-7703、HepG2、HepG2.2.15、Hep3B和SMMC-7721等7個(gè)細(xì)胞系中通過雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)揭示ADAR1 rs4845384多態(tài)性位點(diǎn)對報(bào)告基因活性的影響;構(gòu)建ADAR1過表達(dá)質(zhì)粒和shRNA發(fā)夾質(zhì)粒，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染HBV陽性細(xì)胞系HepG2.2.15以上調(diào)或下調(diào)ADAR1基因表達(dá)水平，ELISA和實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測上清中HBV標(biāo)志物水平，驗(yàn)證ADAR1在

6、HBV感染中是否發(fā)揮作用;構(gòu)建ADAR1基因3'-UTR熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒，用microRNA.org-Targets andExpression、TargetScan、miRTarBase等網(wǎng)站預(yù)測與ADAR1基因相互作用的miRNAs并合成相關(guān)microRNA表達(dá)質(zhì)粒，雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)篩選與ADAR1基因3'-UTR相互作用的miRNA以探討ADAR1基因在HBV感染中發(fā)揮作用的可能機(jī)制。
　　結(jié)果：
　　1.A

7、DAR1 rs4845384對報(bào)告基因活性的影響應(yīng)用pGL3-rs4845384A和pGL3-rs4845384G表達(dá)質(zhì)粒，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染HepG2.2.15、HepG2等6個(gè)肝癌細(xì)胞系和HeLa非肝癌細(xì)胞系，雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果表明，pGL3-rs4845384G表達(dá)活性顯著高于pGL3-rs4845384A(P＜0.05)，尤其在HBV陽性細(xì)胞HepG2.2.15中。IFNα誘導(dǎo)處理后，報(bào)告基因活性均顯著升高。
　　2.ADA

8、R1與HBV感染相關(guān)的體外功能研究1)質(zhì)粒構(gòu)建成功構(gòu)建了ADAR1兩種構(gòu)型(p110，p150)的過表達(dá)質(zhì)粒，以及篩選能夠特異結(jié)合并干擾ADAR1表達(dá)的shRNA，構(gòu)建發(fā)夾質(zhì)粒sh-ADAR1。瞬時(shí)轉(zhuǎn)染HepG2.2.15等細(xì)胞系，過表達(dá)及干擾效果良好。
　　2) HepG2.2.15上清HBV感染標(biāo)志物的檢測瞬時(shí)轉(zhuǎn)染相關(guān)質(zhì)粒72h后，ELISA實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)過表達(dá)ADAR1(p110/p150)后HBsAg和HBeAg均顯著上升(P＜

9、0.05)，干擾后均顯著下降(P＜0.05);提取上清HBV DNA，實(shí)時(shí)熒光定量PCR的研究結(jié)果表明，上調(diào)ADAR1表達(dá)后HBV DNA拷貝數(shù)顯著上升(P＜0.05)，下調(diào)其表達(dá)則HBV DNA拷貝數(shù)顯著減少(P＜0.05)。
　　3.與ADAR13'-UTR相互作用的microRNA初步篩選驗(yàn)證初步篩選出與ADAR1基因3'UTR相互作用的7個(gè)miRNAs:hsa-miR-93，hsa-miR-143,hsa-miR-20b,

10、hsa-miR-20a,hsa-miR-613,hsa-miR-106a,hsa-miR-206。
　　結(jié)論：
　　1.SNP功能實(shí)驗(yàn)提示，rs4845384 G等位基因報(bào)告基因活性較高，rs4845384可能通過調(diào)節(jié)ADAR1表達(dá)水平影響IFNα治療CHB的療效。
　　2.過表達(dá)及干擾ADAR1表達(dá)后HepG2.2.15上清中HBV標(biāo)志物水平顯著升高及降低，ADAR1基因可能促進(jìn)HBV病毒的復(fù)制和分泌。
　　3