HBV感染相關(guān)microRNA的篩選與功能研究.pdf

1、乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)感染是我國(guó)最重大的傳染病之一,我國(guó)約有1.2億HBV攜帶者,其中2000多萬人為慢性乙肝患者。HBV感染及其相關(guān)疾病嚴(yán)重影響著患者的健康,同時(shí)也使患者家庭及社會(huì)承受著巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)?，F(xiàn)在對(duì)HBV感染致病機(jī)理仍不是很清楚,對(duì)HBV感染的治療也未找到特別有效的藥物。目前臨床上廣泛使用的抗HBV感染藥物包括干擾素(interferon,IFN)和核苷(酸)類似物,但使用干擾素副作用較大

2、,而核苷(酸)類似物存在停藥后容易復(fù)發(fā),長(zhǎng)期使用易發(fā)生耐藥變異。因此需要開辟新的思路以研發(fā)出新型高效的HBV感染相關(guān)疾病的治療藥物。
　　microRNA(miRNA)是一類非編碼單鏈小RNA分子,廣泛存在于動(dòng)物、植物及病毒中,廣泛參與諸如細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、凋亡、腫瘤發(fā)生以及病毒發(fā)病機(jī)制等多種過程的調(diào)節(jié)。最近的研究表明在病毒感染宿主的過程中,miRNA可能扮演了重要的作用。本研究旨在進(jìn)行HBV感染相關(guān)miRNA分子的篩選并進(jìn)行分子機(jī)

3、制研究,希望上述研究結(jié)果能為從miRNA角度闡明HBV的感染機(jī)制提供理論依據(jù),同時(shí)也為HBV感染相關(guān)疾病的診斷和治療提供潛在的診斷標(biāo)志物和藥物靶標(biāo)。
　　本研究利用已建立的miRNA表達(dá)載體庫(kù)在細(xì)胞瞬時(shí)轉(zhuǎn)染模型中進(jìn)行HBV復(fù)制相關(guān)miRNA分子的篩選并選擇其中具有代表性的miRNA分子進(jìn)行抗HBV復(fù)制的分子機(jī)制研究。本論文的研究?jī)?nèi)容主要包括以下兩個(gè)方面:1)利用miRNA表達(dá)載體庫(kù)轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞,進(jìn)行HBV復(fù)制相關(guān)miRNA分

4、子的篩選;2)miR-141抑制HBV復(fù)制的分子機(jī)制研究。本研究所獲得的研究結(jié)果如下:
　　1、采用miRNA表達(dá)載體與HBV表達(dá)載體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞作為篩選模型對(duì)miRNA表達(dá)載體庫(kù)進(jìn)行了篩選,共獲得了6條與HBV復(fù)制相關(guān)的miRNA分子。對(duì)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞培養(yǎng)液上清的HBsAg檢測(cè)表明miR-98,miR-137分子與HBV表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染后細(xì)胞上清HBsAg水平升高;miR-101,miR-125a,miR-125b,mi

5、R-141分子與HBV表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染后細(xì)胞上清HBsAg水平下降。
　　2、通過生物信息學(xué)方法對(duì)上述6個(gè)miRNA的宿主靶基因進(jìn)行了預(yù)測(cè),結(jié)果包含數(shù)個(gè)參與細(xì)胞轉(zhuǎn)錄調(diào)控及重要信號(hào)通路的基因,其中已有研究表明FOXA1,PPARA,RXRA等是HBV復(fù)制所必需的細(xì)胞調(diào)控因子。采用luciferase報(bào)告基因?qū)ι鲜鰉iRNA與這些靶基因的相互作用進(jìn)行了驗(yàn)證。結(jié)果表明miR-101與HNF1B3’-UTR,miR-137與NF1及SP13

6、’-UTR,miR-141與PPARA3’-UTR產(chǎn)生相互作用,抑制luciferase活性。
　　3、miR-141抑制HBV復(fù)制的機(jī)制研究?；诩?xì)胞瞬時(shí)轉(zhuǎn)染篩選結(jié)果及l(fā)uciferase報(bào)告基因靶位點(diǎn)的驗(yàn)證結(jié)果,我們選擇miR-141分子作為抑制HBV復(fù)制的研究對(duì)象。通過細(xì)胞瞬時(shí)轉(zhuǎn)染驗(yàn)證了合成miR-141分子(miR-141mimics)對(duì)HBV抗原(HBs/HBe)及病毒DNA都具有抑制作用,miR-141抑制劑(miR-

7、141inhibitor)則對(duì)HBV抗原(HBs/HBe)表達(dá)具有促進(jìn)作用,證明了篩選結(jié)果的正確;采用miRNA分子靶基因預(yù)測(cè)軟件(TargetScan)對(duì)PPARA基因序列中miR-141可能的靶位點(diǎn)進(jìn)行了預(yù)測(cè),結(jié)果顯示PPARA3’-UTR含有4個(gè)miR-141可能的靶標(biāo)。采用luciferase報(bào)告基因?qū)︻A(yù)測(cè)靶標(biāo)位點(diǎn)的正確性進(jìn)行了驗(yàn)證,結(jié)果顯示miR-141可以與PPARA3’-UTR中3個(gè)靶位點(diǎn)產(chǎn)生作用;通過PPARA特異性si

8、RNA驗(yàn)證了抑制PPARA表達(dá)后對(duì)HBV抗原(HBs/HBe)及病毒DNA復(fù)制具有抑制,證明了miR-141作用于HBV復(fù)制的可能性;采用luciferase報(bào)告基因進(jìn)行的啟動(dòng)子功能分析表明,miR-141對(duì)PPARA的抑制作用可以降低HBV基因組啟動(dòng)子活性,闡明了miR-141抑制HBV復(fù)制的分子途徑。
　　綜上所述,本研究采用瞬時(shí)轉(zhuǎn)染細(xì)胞模型對(duì)miRNA表達(dá)載體庫(kù)進(jìn)行了篩選并驗(yàn)證了miR-141對(duì)HBV復(fù)制具有抑制作用,發(fā)現(xiàn)H