Derlin-1基因功能的初步研究.pdf

1、Derlin-1是2001年利用消減抑制雜交技術(shù)克隆的一個新基因。該基因定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上，參與錯誤折疊蛋白從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔到細(xì)胞質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)。2003年，首次發(fā)現(xiàn)Derlin-1在人肝海綿血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞中的表達(dá)與其它多種血管內(nèi)皮細(xì)胞相比顯著下調(diào)，同時，首次觀察到人肝海綿血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞中的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)異常膨脹。到目前為止，Derlin-1與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)異常之間的關(guān)系未見報道。因此，本文以人肝海綿血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞為模型，對Deflin-1在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上表達(dá)的作用及

2、其功能展開了研究。此外，通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，除了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)以外，Derlin-1也可能定位于質(zhì)膜上。到目前為止，Derlin-1在質(zhì)膜上的定位及功能也未見報道。因此，文中也對Derlin-1新的亞細(xì)胞定位及其可能具有的新的功能也展開了研究。 一、Derlin-1在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上表達(dá)的功能及機(jī)理研究。采用RT-PCR、Western blot、組織免疫熒光等方法，從體內(nèi)外水平檢測Derlin-1在多種人血管內(nèi)皮細(xì)胞中的表達(dá)，結(jié)果顯示De

3、rlin-1在人肝海綿血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞中的表達(dá)水平顯著低于其它血管內(nèi)皮細(xì)胞。采用透射電鏡技術(shù)，從體內(nèi)外水平觀察多種人血管內(nèi)皮細(xì)胞中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的超微結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)Derlin-1表達(dá)下調(diào)的人肝海綿血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)異常膨脹，而其它血管內(nèi)皮細(xì)胞中的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)正常。將含Derlin-1基因的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人肝海綿血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)50個細(xì)胞中有26個細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)恢復(fù)正常，而空載體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)仍異常膨脹。根據(jù)這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果推斷，人肝海綿血管瘤內(nèi)皮

4、細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的異常膨脹可能與Derlin-1的表達(dá)下調(diào)有關(guān)。 采用RT-PCR、組織免疫熒光等方法，從體內(nèi)外水平檢測未折疊蛋白應(yīng)急反應(yīng)(unfolded protein response，UPR)活化的標(biāo)記基因Bip或XBP1在多種人血管內(nèi)皮細(xì)胞中的表達(dá)或剪接情況。結(jié)果顯示：Derlin-1表達(dá)下調(diào)的人肝海綿血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞中，Bip表達(dá)顯著上調(diào)，XBP1發(fā)生了UPR特異的剪接，表明UPR得到活化。將含Derlin-1基因的重組質(zhì)粒

5、轉(zhuǎn)染人肝海綿血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞，RT-PCR結(jié)果顯示，Bip的表達(dá)水平下調(diào)，XBP1的剪接程度下降，表明UPR的活化程度降低。根據(jù)這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果，推斷UPR可能是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)異常膨脹和Derlin-1表達(dá)下調(diào)相關(guān)的分子機(jī)制之一。 二、Dorlin-1在腫瘤細(xì)胞質(zhì)膜上的表達(dá)及其功能的初步研究。采用RNAi技術(shù)敲降Derlin-1在人宮頸癌細(xì)胞：HeLa中的表達(dá)，結(jié)果顯示，RNAi介導(dǎo)的Derlin-1表達(dá)下調(diào)對HeLa細(xì)胞的增殖、凋亡和細(xì)胞周

6、期均無明顯影響，表明Derlin-1對于HeLa細(xì)胞的功能并不是必不可少的。 采用多款生物軟件預(yù)測Derlin-1的亞細(xì)胞定位，發(fā)現(xiàn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)駐留蛋白Derlin-1也可能定位于質(zhì)膜上。在該部分研究中，活細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Derlin-1表達(dá)于多種腫瘤細(xì)胞的質(zhì)膜上，而且呈極性表達(dá)，即只表達(dá)于細(xì)胞膜的基質(zhì)面上。競爭抑制實(shí)驗(yàn)證明，Derlin-1抗體對腫瘤細(xì)胞質(zhì)膜的染色是特異的。Derlin-1與CEA的共定位研究進(jìn)一步證明，D

7、erlin-1表達(dá)于腫瘤細(xì)胞質(zhì)膜上。利用胰酶消化后的腫瘤細(xì)胞進(jìn)行活細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明質(zhì)膜上的Derlin-1蛋白的C端面向胞外。 采用活細(xì)胞免疫熒光、冰凍切片免疫熒光等方法，從體內(nèi)水平檢測Derlin-1的亞細(xì)胞定位，結(jié)果顯示，Derlin-1表達(dá)于活體來源的或切片上的結(jié)腸癌細(xì)胞的質(zhì)膜上。用<'125>I標(biāo)記的Derlin-1抗體進(jìn)行體內(nèi)分布及顯像研究，結(jié)果顯示，Derlin-1在腫瘤組織特異聚集，表明Derlin-1特

8、異表達(dá)于結(jié)腸癌細(xì)胞的質(zhì)膜上。 在體外利用Derlin-1抗體封閉結(jié)腸癌細(xì)胞質(zhì)膜上的Derlin-1，結(jié)果顯示，Derlin-1抗體對結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖、凋亡和細(xì)胞周期無明顯影響，但對結(jié)腸癌細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)Collagen I之間的粘附有抑制作用，提示Derlin-1可能在腫瘤細(xì)胞的粘附中發(fā)揮作用。利用Derlin-1抗體進(jìn)行體內(nèi)抑瘤實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示，不同劑量的Derlin-1抗體均能夠顯著抑制結(jié)腸癌移植瘤的生長，高劑量和低劑量的抑瘤

9、率分別為54.84％和53.23％。免疫組化結(jié)果顯示，與對照組相比，Derlin-1抗體治療組中PCNA和Ki67陽性細(xì)胞的比例顯著降低，p27的表達(dá)上調(diào)，表明Derlin-1抗體能夠抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖，而p27表達(dá)上調(diào)是其中機(jī)制之一。此外，與對照組相比，Derlin-1抗體治療組中的β-catenin表達(dá)下調(diào)，表明Derlin-1抗體能夠抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的粘附。免疫組化的結(jié)果提示，Derlin-1抗體可能通過抑制細(xì)胞的增殖、粘附來抑制