煙草DAD1基因功能初探.pdf

1、程序性細(xì)胞死亡(programmed cell death, PCD)是由多基因控制的細(xì)胞自主有序的死亡過程，能夠維持生物內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。動物抗細(xì)胞凋亡基因（defender againstapoptotic cell death，DAD1）被認(rèn)為是細(xì)胞凋亡的負(fù)調(diào)控基因，具有拮抗PCD的能力，可能在Bcl-2蛋白下游發(fā)揮作用。之后研究發(fā)現(xiàn)DAD1是寡聚糖轉(zhuǎn)移酶（oligosaccharyltransferase，OST）復(fù)合物的亞基組分，

2、其缺失將影響蛋白質(zhì)的N-糖基化。DAD1基因在植物中的直向同源物可能影響植物生長發(fā)育，并在抵御PCD中發(fā)揮作用。本研究通過模式植物煙草，初步探索DAD1基因的生物學(xué)功能，以期為研究DAD1功能作用的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)，具體研究如下:
　　從本氏煙分離出NbDAD1 cDNA序列，全長351bp，編碼的蛋白質(zhì)在動植物中均十分保守，具有3個疏水性跨膜區(qū)域。qRT-PCR分析發(fā)現(xiàn)NbDAD1基因在本氏煙根、莖、葉、花及不同發(fā)育階段的葉中均

3、表達(dá)，且根與莖中NbDAD1基因表達(dá)水平高于葉與花;隨著葉片的衰老，Nb DAD1基因表達(dá)水平逐漸增高。
　　應(yīng)用病毒誘導(dǎo)的基因沉默(virus induced gene silencing，VIGS)技術(shù)沉默本氏煙中NbDAD1 cDNA C端片段及全長，不同苗齡的本氏煙植株呈現(xiàn)不同沉默表型:注射時達(dá)10葉期的沉默植株與對照植株相比，植株矮小、根生長減緩，新葉葉色深綠、大部分花敗育，頂芽轉(zhuǎn)變花芽，腋芽數(shù)明顯增加;注射時6葉期的沉

4、默植株基本生長停滯、老葉黃化，頂芽轉(zhuǎn)變?yōu)榛ㄑ?，未觀察到花器官，腋芽明顯減少。相關(guān)生理生化指標(biāo)分析發(fā)現(xiàn)Nb DAD1基因沉默的葉綠素a、葉綠素b、類胡蘿卜素c含量及POD酶活均較未沉默植株均有所提高，其中POD酶活顯著增加。應(yīng)用qRT-PCR分析沉默植株和TRV對照植株中NbDAD1基因表達(dá)，發(fā)現(xiàn)沉默植株的表達(dá)高于對照植株，推測可能是本氏煙中還存在冗余基因DAD2，對植株DAD1基因沉默后進(jìn)行代償。此外，我們檢測了沉默植株和TRV對照植株

5、中YUCCA6、PIN1（IAA合成中關(guān)鍵酶關(guān)鍵基因）、IPT、AHK2、AHK3、ARR4（CTK合成關(guān)鍵酶基因）、CCD7、CCD8、BCR1（SL合成關(guān)鍵酶基因）以及BR合成關(guān)鍵酶基因CPD、DET1基因表達(dá)。
　　將本氏煙DAD1基因分別構(gòu)建至超表達(dá)載體、攜帶HAtag標(biāo)簽的超表達(dá)載體及RNAi載體，通過根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)葉盤法轉(zhuǎn)化本氏煙，并經(jīng)潮霉素篩選獲得抗性植株。結(jié)果發(fā)現(xiàn):本氏煙植株超表達(dá)抗性植株與轉(zhuǎn)入空載的對照植株無明顯

6、表型差異;攜帶HAtag標(biāo)簽的超表達(dá)抗性植株葉片肥厚，莖干粗壯，花器官數(shù)目多，腋芽明顯減少;RNAi抗性植株主莖細(xì)小、新葉葉色深綠、老葉生長停滯，大部分花敗育，分蘗數(shù)和腋芽數(shù)顯著增加;對本氏煙RNAi抗性植株及對照植株石蠟切片觀察，發(fā)現(xiàn)RNAi抗性植株莖中木質(zhì)部所占比例明顯增大，葉片海綿組織增厚，花中可見發(fā)育不完全的胚珠。將普通煙草品種W38 NtDAD1同源基因分離、構(gòu)建超表達(dá)載體、攜帶HAtag標(biāo)簽的超表達(dá)載體及RNAi載體及遺傳轉(zhuǎn)